小白菊內(nèi)酯對(duì)人肺癌A-549細(xì)胞周期變化和凋亡通路影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究小白菊內(nèi)酯對(duì)人肺癌A-549細(xì)胞株的抗增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用及其機(jī)制，為研發(fā)新型抗腫瘤中藥奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　方法：應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法培養(yǎng)人肺癌 A-549細(xì)胞；應(yīng)用 MTT法測定小白菊內(nèi)酯對(duì)肺癌細(xì)胞的毒性作用和抑制增殖作用；應(yīng)用倒置顯微鏡、HE染色光學(xué)顯微鏡、吖啶橙（AO）/溴化乙錠（EB）雙染色熒光顯微鏡及Annexin V-FITC/碘化丙錠(PI)染色熒光顯微鏡等觀察藥物作用前后人肺癌 A-549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)

2、變化；應(yīng)用活性氧（ROS）檢測藥物作用后細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，以及活性氧含量與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測藥物作用之后腫瘤細(xì)胞周期分布以及誘導(dǎo)凋亡的情況；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測藥物作用前后蛋白陽性表達(dá)變化的情況并進(jìn)一步探討小白菊內(nèi)酯對(duì)人肺癌 A-549細(xì)胞株抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：（1）MTT法結(jié)果顯示：小白菊內(nèi)酯在不同濃度對(duì)人肺癌A-549細(xì)胞有不同程度的生長抑制作用，并呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間梯度

3、依賴性。（2）顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體積縮小、變圓，核染色質(zhì)聚集成團(tuán)，細(xì)胞之間的連接疏松，貼壁不牢，易脫落。HE染色觀察到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體積變小，數(shù)目減少，可見部分細(xì)胞核固縮碎裂以及凋亡的細(xì)胞；AO/EB熒光雙染顯微鏡觀察：對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，而實(shí)驗(yàn)組中早期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)黃綠色熒光，隨著小白菊內(nèi)酯作用時(shí)間的延長，呈現(xiàn)橘紅色熒光的晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞；Annexin V-FITC/PI染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)

4、胞可見大量綠色熒光細(xì)胞和紅色凋亡細(xì)胞。（3）活性氧檢測發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平出現(xiàn)明顯升高。（4）流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果觀察：G0/G1期細(xì)胞減少，而S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量明顯增多，說明人肺癌 A-549細(xì)胞株被阻滯于S期和G2/M期（P<0.05）。（5）免疫細(xì)胞化學(xué)檢測法結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Fas和Bax的表達(dá)增加,而Bcl-2、Ki-67、Livin、Survivin和

5、NF-κB表達(dá)降低,與對(duì)照組相比有顯著差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.小白菊內(nèi)酯對(duì)人肺癌A-549細(xì)胞有明顯的抑制增殖作用,并且呈濃度和時(shí)間依賴性，其抑制增殖的作用機(jī)制可能與細(xì)胞周期發(fā)生S期和G2/M期阻滯有關(guān)。
　　2.小白菊內(nèi)酯作用于人肺癌A-549細(xì)胞株后,誘導(dǎo)其出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的改變，它通過死亡受體通路和線粒體通路來完成誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，NF-κB有可能參與了小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)人肺癌A-549細(xì)胞凋亡的作用。