siRNA-ZNF139胃癌細胞對化療藥物敏感性及ZNF139相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究.pdf

1、胃癌是嚴重威脅人類生命健康的主要疾病之一，當(dāng)前已經(jīng)成為全球重大的公共衛(wèi)生問題。在我國胃癌發(fā)病率和死亡率均占消化系統(tǒng)惡性腫瘤的第一位。由于胃癌的早期癥狀不典型，當(dāng)患者出現(xiàn)明顯不適癥狀時，病情往往已經(jīng)發(fā)展的較晚，失去了行根治性手術(shù)的機會，對于這部分患者，化療成為其治療的主要手段。雖然近年來不斷研究出新的化療藥物及改進的聯(lián)合化療方案，但胃癌患者的化療效果仍然不盡如人意。胃癌的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)往往是導(dǎo)

2、致化療治療效果欠佳的主要原因之一。MDR發(fā)生的機制較為復(fù)雜，而且受到多種因素影響，研究逆轉(zhuǎn)MDR的有效方法已經(jīng)成為提高化療療效的關(guān)鍵。因此，如何逆轉(zhuǎn)胃癌的MDR，提高胃癌化療療效，成為當(dāng)前胃癌研究中的熱點，也是臨床胃癌治療中急待解決的問題。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是以基因編碼的所有蛋白質(zhì)組為研究對象，從整體水平上分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，進而揭示蛋白質(zhì)功

3、能及其與細胞生命活動規(guī)律的關(guān)系。蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)體系是以雙相凝膠電泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-DE)為主的蛋白質(zhì)分離技術(shù)和以質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)、生物信息學(xué)(Bioinformatics)為主的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)。
　　本實驗共分為四部分，第一部分應(yīng)用siRNA抑制人胃癌SGC7901細胞中ZNF139表達及并研究其對化療藥物

4、敏感性影響;第二部分應(yīng)用siRNA抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139表達及并研究其對化療藥物敏感性影響。通過第一、二部分的研究，得出應(yīng)用siRNA能夠抑制人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中ZNF139的表達，抑制ZNF139的表達后能夠提高胃癌細胞對于化療藥物的敏感性。第三部分應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對siRNA抑制人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中前后的差異蛋白進行分離鑒定，尋找與ZNF139參與胃癌發(fā)生、發(fā)展及多藥

5、耐藥有可能相關(guān)的蛋白。通過第三部分的研究，得出ZNF139有可能通過PDXK、ANXA2及Fascin而參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及多藥耐藥。第四部分應(yīng)用qRT-PCR及Western blot法檢測各實驗組人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin的表達情況。通過第四部分的研究，得出ZNF139有可能通過促進ANXA2、Fascin的表達及抑制PDXK的表達來參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及多藥耐藥等過程。

6、　　本課題四部分的具體內(nèi)容如下:
　　第一部分、siRNA抑制人胃癌SGC7901細胞中ZNF139表達及其對化療藥物敏感性影響的研究
　　目的:以人胃癌SGC7901細胞為研究對象，檢測siRNA抑制人胃癌SGC7901細胞前后ZNF139的表達情況，并研究其對化療藥物敏感性的影響。
　　方法:
　　1.設(shè)計合成針對ZNF139的小干擾RNA，構(gòu)建siRNA-ZNF139表達質(zhì)粒。培養(yǎng)人胃癌SGC7901細胞，

7、應(yīng)用siRNA-ZNF139質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細胞。
　　2.qRT-PCR檢測各實驗組人胃癌SGC7901細胞中ZNF139 mRNA表達水平的變化。
　　3.Western blot法檢測各實驗組人胃癌SGC7901細胞中ZNF139蛋白表達水平的變化。
　　4.MTT法檢測各實驗組人胃癌SGC7901細胞對于化療藥物敏感性的變化。
　　結(jié)果:
　　1.各實驗組人胃癌SGC7901細胞中ZNF

8、139 mRNA表達水平的變化。
　　分別用3個陽性質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒以濃度為0.8μg/μl轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細胞48小時，依據(jù)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)空白對照組與陰性對照組中ZNF139 mRNA的相對表達量最高，且二者之間表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);1號陽性質(zhì)粒組中ZNF139 mRNA的相對表達量為最低，且其與空白對照組ZNF139 mRNA的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各實驗組中以1號陽性質(zhì)粒組Z

9、NF139的抑制效率最高，為84.41％。
　　選用1號陽性質(zhì)粒，以0.4μg/μl、0.6μg/μl、0.8μg/μl、1.0μg/μl的濃度梯度轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細胞48小時，依據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組ZNF139 mRNA的相對表達量最高;濃度為0.8μg/μl組的ZNF139 mRNA的相對表達量最低，且其與空白對照組ZNF139 mRNA的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各實驗組中以濃度0.8μg/μl

10、組ZNF139的抑制效率最高，為84.42％。
　　選用濃度為0.8μg/μl的1號陽性質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染胃癌細胞24小時、48小時、72小時，依據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組ZNF139 mRNA的相對表達量最高;轉(zhuǎn)染48小時實驗組的ZNF139 mRNA表達量最低，且其與空白對照組ZNF139 mRNA的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各實驗組中以轉(zhuǎn)染48小時實驗組ZNF139的抑制效率最高，為84.36％。
　　2.

11、各實驗組人胃癌SGC7901細胞中ZNF139蛋白表達水平的變化。
　　應(yīng)用Western blot法檢測各實驗組ZNF139蛋白表達水平的變化。實驗結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致。
　　3.各實驗組人胃癌SGC7901細胞對于化療藥物敏感性的變化依據(jù)前面實驗部分得到結(jié)果，選用0.8μg/μl濃度的1號陽性質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細胞48小時后，應(yīng)用MTT法檢測各實驗組人胃癌SGC7901細胞對于5-FU、

12、ADR、CDDP、L-OHP、MMC、MTX、VP-16這7種化療藥物敏感性的變化。依據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組與陰性對照組中相互之間各自比較細胞平均抑制率，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。siRNA-ZNF139組中各自較空白對照組細胞平均抑制率明顯升高，且二者之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.siRNA能夠抑制人胃癌SGC7901細胞中ZNF139mRNA的表達。
　　2.siRNA能夠抑

13、制人胃癌SGC7901細胞中ZNF139蛋白的表達。
　　3.siRNA抑制人胃癌SGC7901細胞中ZNF139的表達能夠提高胃癌細胞對于5-FU、ADR、CDDP、L-OHP、MMC、MTX、VP-16這7種化療藥物的敏感性。
　　第二部分、siRNA抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139表達及其對化療藥物敏感性影響的研究
　　目的:以人胃癌SGC7901細胞裸鼠原位移植瘤為研究對象，檢測siRNA抑制人胃癌裸鼠原

14、位移植瘤前后ZNF139的表達情況，并研究其對化療藥物敏感性的影響。
　　方法:
　　1.人胃癌裸鼠原位移植瘤模型的建立及干預(yù)收集體外培養(yǎng)的人胃癌SGC7901細胞，建立裸鼠皮下移植瘤模型，傳代5次，獲取生長旺盛的第6代皮下移植瘤，將第6代皮下移植瘤應(yīng)用OB生物膠粘貼法進行原位移植。術(shù)后每日觀察裸鼠腹部切口、進食及腹腔原位移植瘤生長情況。待原位移植瘤長至直徑約10 mm左右時，分別隨機按照空白對照組、siRNA-ZNF139

15、組、siRNA-ZNF139+奧沙利鉑組、奧沙利鉑組及陰性對照組進行干預(yù)。干預(yù)期間，隔日測量一次瘤體長、短徑，并按照V=ab2/2（a為瘤體長徑，b為瘤體短徑）計算原位移植瘤體積。干預(yù)處理兩周后，取出原位移植瘤。
　　2.qRT-PCR檢測各實驗組人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139 mRNA表達水平的變化。
　　3.Western blot法檢測各實驗組人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139蛋白表達水平的變化。
　　4.M

16、TT法檢測各實驗組人胃癌裸鼠原位移植瘤對于化療藥物敏感性的變化。
　　結(jié)果:
　　1.人胃癌裸鼠原位移植瘤模型干預(yù)后的形態(tài)觀察干預(yù)處理兩周后，統(tǒng)計各實驗組原位移植瘤體積(V=ab2/2，a為瘤體長徑，b為瘤體短徑)。依據(jù)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)空白對照組與陰性對照組中原位移植瘤的體積最大，且二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;siRNA-ZNF139+奧沙利鉑組中原位移植瘤的體積最小，且其與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.

17、05); siRNA-ZNF139組與空白對照組原位移植瘤的體積比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);siRNA-ZNF139組與siRNA-ZNF139+奧沙利鉑組原位移植瘤的體積比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);奧沙利鉑組與空白對照組原位移植瘤的體積比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);奧沙利鉑組與siRNA-ZNF139+奧沙利鉑組原位移植瘤的體積比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);siRNA-ZNF139組與奧沙利鉑組原位

18、移植瘤的體積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.各實驗組人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139 mRNA表達水平的變化依據(jù)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)空白對照組與陰性對照組中ZNF139 mRNA的相對表達量最高，且二者之間表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;siRNA-ZNF139組中ZNF139 mRNA的相對表達量為最低，且其與空白對照組ZNF139 mRNA的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。siRNA-ZNF13

19、9組ZNF139的抑制效率為81.05％。
　　3.各實驗組人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139蛋白表達水平的變化應(yīng)用Western blot法檢測各實驗組ZNF139蛋白表達水平的變化。實驗結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致。
　　4.各實驗組人胃癌裸鼠原位移植瘤組織對于化療藥物敏感性的變化應(yīng)用MTT法檢測各實驗組人胃癌裸鼠原位移植瘤組織細胞對于5-FU、ADR、 CDDP、L-OHP、MMC、MTX、VP-16這7種化療藥物敏感

20、性的變化。依據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組與陰性對照組中相互之間各自比較細胞平均抑制率，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。siRNA-ZNF139組中各自較空白對照組細胞平均抑制率明顯升高，且二者之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.siRNA-ZNF139能夠抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤的生長。
　　2.siRNA能夠抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139 mRNA的表達。
　　3.siRNA能夠抑

21、制人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139蛋白的表達。
　　4.siRNA抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤中ZNF139的表達能夠提高原位移植瘤組織對于5-FU、ADR、 CDDP、L-OHP、MMC、MTX、VP-16這7種化療藥物的敏感性。
　　第三部分、siRNA抑制人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中ZNF139表達的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　目的:以人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤為研究對象，通過雙向熒光差異凝

22、膠電泳(2D-DIGE)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究各實驗組人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中差異蛋白的表達情況。
　　方法:應(yīng)用雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)技術(shù)分別分離各實驗組人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤蛋白質(zhì)，選擇差異點，并用Ettan spot picker挖取，挖取點行膠內(nèi)酶解，應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)鑒定技術(shù)對挖取的蛋白質(zhì)點鑒定，并對鑒定出的蛋白質(zhì)進

23、行分析。
　　結(jié)果:人胃癌SGC7901細胞雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)圖譜上蛋白質(zhì)點為1958±67個，匹配率為90.5％，人胃癌裸鼠原位移植瘤2D-DIGE圖譜上蛋白質(zhì)點為5227±59，匹配率為88.7％。
　　在人胃癌SGC7901細胞中選取8個差異明顯的蛋白點，經(jīng)由LC-MS鑒定出6種蛋白質(zhì):吡哆醛激酶(pyridoxal kinase，PDXK)、結(jié)蛋白(Desmin)、核磷蛋白(nucleophosm

24、in，NPM)、熱休克蛋白70(heat shockprotein70，HSP70)、膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2，ANXA2)、和Fascin。在siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染后的人胃癌SGC7901細胞中PDXK、Desmin、NPM表達上調(diào)，HSP70、ANXA2、Fascin表達下調(diào)。
　　在人胃癌裸鼠原位移植瘤中選取6個差異明顯的蛋白點，經(jīng)由LC-MS鑒定出5種蛋白質(zhì):ANXA1、PDXK、Fascin、ANXA2、

25、不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)。在siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染后的人胃癌裸鼠原位移植瘤中ANXA1、PDXK表達上調(diào)，F(xiàn)ascin、ANXA2、hnRNP表達下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.在siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染后的人胃癌SGC7901細胞中PDXK、Desmin、NPM表達上調(diào)，HSP70、ANXA2、Fascin表達下調(diào)。
　　2.

26、在siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染后的人胃癌裸鼠原位移植瘤中ANXA1、PDXK表達上調(diào)，F(xiàn)ascin、ANXA2、hnRNP表達下調(diào)。
　　3.ZNF139可能通過調(diào)節(jié)PDXK、ANXA2及Fascin而參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及多藥耐藥。
　　第四部分、siRNA-ZNF139對人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin表達影響的研究
　　目的:以人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植

27、瘤為研究對象，檢測各實驗組人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin的表達情況。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)人胃癌SGC7901細胞，應(yīng)用siRNA-ZNF139質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細胞。
　　2.人胃癌裸鼠原位移植瘤模型的建立及干預(yù)
　　3.qRT-PCR檢測各實驗組人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin mRNA表達水平的變化。

28、
　　4.Western blot法檢測各實驗組人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin蛋白表達水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.各實驗組人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin mRNA表達水平的變化應(yīng)用qRT-PCR檢測空白對照組、siRNA-ZNF139組及陰性對照組中人胃癌SGC7901細胞中PDXK mRNA表達水平的變化。依據(jù)結(jié)果可

29、以發(fā)現(xiàn)空白對照組與陰性對照組中PDXK mRNA的相對表達量較低，且二者之間表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;siRNA-ZNF139組中PDXK mRNA的相對表達量為最高，且其與空白對照組PDXK mRNA的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　應(yīng)用qRT-PCR檢測空白對照組、siRNA-ZNF139組及陰性對照組中人胃癌SGC7901細胞中ANXA2 mRNA表達水平的變化。依據(jù)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)空白對照組與

30、陰性對照組中ANXA2 mRNA的相對表達量最高，且二者之間表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;siRNA-ZNF139組中ANXA2mRNA的相對表達量為最低，且其與空白對照組ANXA2 mRNA的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　應(yīng)用qRT-PCR檢測空白對照組、siRNA-ZNF139組及陰性對照組中人胃癌SGC7901細胞中Fascin mRNA表達水平的變化。依據(jù)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)空白對照組與陰性對照組中

31、Fascin mRNA的相對表達量最高，且二者之間表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05); siRNA-ZNF139組中Fascin mRNA的相對表達量為最低，且其與空白對照組Fascin mRNA的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　應(yīng)用qRT-PCR檢測空白對照組、siRNA-ZNF139組及陰性對照組中人胃癌裸鼠原位移植瘤中PDXK mRNA表達水平的變化。依據(jù)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)空白對照組與陰性對照組中PDXK

32、mRNA的相對表達量較低，且二者之間表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;siRNA-ZNF139組中PDXKmRNA的相對表達量為最高，且其與空白對照組PDXK mRNA的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　應(yīng)用qRT-PCR檢測空白對照組、siRNA-ZNF139組及陰性對照組中人胃癌裸鼠原位移植瘤中ANXA2 mRNA表達水平的變化。依據(jù)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)空白對照組與陰性對照組中ANXA2 mRNA的相對表達量最

33、高，且二者之間表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);siRNA-ZNF139組中ANXA2mRNA的相對表達量為最低，且其與空白對照組ANXA2 mRNA的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　應(yīng)用qRT-PCR檢測空白對照組、siRNA-ZNF139組及陰性對照組中人胃癌裸鼠原位移植瘤中Fascin mRNA表達水平的變化。依據(jù)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)空白對照組與陰性對照組中Fascin mRNA的相對表達量最高，且二者之間

34、表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;siRNA-ZNF139組中FascinmRNA的相對表達量為最低，且其與空白對照組Fascin mRNA的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.各實驗組人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中PDXK、ANXA2及Fascin蛋白表達水平的變化。
　　應(yīng)用Western blot法檢測各實驗組PDXK、ANXA2及Fascin蛋白表達水平的變化。實驗結(jié)果與qRT

35、-PCR結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　1.siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤后，PDXK mRNA的表達水平上升，ANXA2 mRNA及Fascin mRNA的表達水平降低。
　　2.siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤后，PDXK蛋白的表達水平上升，ANXA2蛋白及Fascin蛋白的表達水平降低。
　　3.ZNF139有可能通過促進ANXA2、

36、Fascin的表達及抑制PDXK的表達來參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及多藥耐藥等過程。
　　綜合上述四部分實驗內(nèi)容，本研究小結(jié)如下:
　　1.siRNA能夠抑制人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中ZNF139 mRNA的表達。
　　2.siRNA能夠抑制人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中 ZNF139蛋白的表達。
　　3.siRNA抑制人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤中ZNF139的表達能夠提

37、高胃癌細胞對于化療藥物的敏感性。
　　4.siRNA-ZNF139能夠抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤的生長。
　　5.在siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染后的人胃癌SGC7901細胞中PDXK、Desmin、NPM表達上調(diào)，HSP70、ANXA2、Fascin表達下調(diào)。在siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染后的人胃癌裸鼠原位移植瘤中ANXA1、PDXK表達上調(diào)，F(xiàn)ascin、ANXA2、hnRNP表達下調(diào)。
　　6.siRNA-ZNF13

38、9轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤后，PDXK mRNA的表達水平上升，ANXA2 mRNA及Fascin mRNA的表達水平降低。
　　7.siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細胞及其裸鼠原位移植瘤后，PDXK蛋白的表達水平上升，ANXA2蛋白及Fascin蛋白的表達水平降低。
　　8.ZNF139有可能通過促進ANXA2、Fascin的表達及抑制PDXK的表達來參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及多藥耐藥等過