牛乳中摻加膠原水解蛋白檢測方法的建立.pdf

1、牛乳是由母奶牛乳腺分泌出的一種具有膠體特性，含有幼畜生長發(fā)育所必需的全部營養(yǎng)成分的均勻生物學液體，具有較高的營養(yǎng)價值，其中含有許多促進人類生長發(fā)育及維持健康水平所必需的營養(yǎng)成分。乳蛋白是乳營養(yǎng)中最重要部分之一，乳蛋白含量已經(jīng)成為現(xiàn)在許多牛乳收購計價系統(tǒng)的基礎物質之一。由于乳及乳制品中蛋白含量較高且相對固定。因此，向乳中添加其它蛋白如動物蛋白、植物蛋白來代替乳蛋白，增加乳中蛋白含量，己經(jīng)成為現(xiàn)在中國牛乳摻假的重要手段。 摻假乳不但

2、降低了乳產(chǎn)品營養(yǎng)價值，嚴重的還會導致食物的安全問題，直接影響了奶農、生產(chǎn)廠家和消費者的利益?，F(xiàn)有的各種摻假檢測方法都存在一定的局限性，很多只適合于在實驗室內使用，需要復雜的樣品處理過程和昂貴的藥品、設備，還不能應用于實踐當中：有些只能對特定摻假物進行檢測，其它一些摻假物可能會對此檢測方法有影響；有些需要時間過長，不利于現(xiàn)場檢測。為此，本文結合牛乳驗收過程中存在的實際問題，建立牛乳摻假的檢測方法。 本試驗通過近一年的研究，分別開發(fā)

3、了比色法、離子交換色譜．積分脈沖安培法(anionic exchange chromatograph-integral pulse ampere determination,HPEAC-IPAD，)和2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitro fluorobenzene,DNFB，)柱前衍生高效液相色譜法用于檢測牛乳中摻加的水解膠原蛋白。 1．比色法檢測牛乳中摻加的膠原水解蛋白在膠原的羥脯氨酸(hydroxyproline，Hy

4、p)測定中，傳統(tǒng)的酸法水解是在110℃下使用6mol/L的HCl消解24h，其操作步驟繁瑣且所花時間較長。通過旋轉回歸設計對酸水解條件的優(yōu)化，簡化Hyp測定的操作步驟，縮短酸水解時間。HCl濃度，水解時間和反應溫度對Hyp的測定具有顯著影響。酸法水解測定Hyp的優(yōu)化條件為：HCl濃度11.6mol/L，水解溫度為110℃，水解時間6h。使用優(yōu)化后的條件測定Hyp縮短了測定時間，簡化了操作，而且靈敏度和重復性較好，可用于快速測定膠原水解蛋

5、白中的Hyp含量。 膠原水解蛋白中含有高比例的Hyp，采用分光光度計比色法首先測定Hyp的含量，由測得的Hyp量乘以7.93即可得出乳中摻加的動物膠原水解蛋白的量。 該方法的準確度和重復性均較好。此方法所用儀器操作簡便、經(jīng)濟，且操作方法步驟簡單。采用優(yōu)化后的水解條件來水解動物膠原水解蛋白，可大大縮短水解時間，可以快速的檢測牛乳中摻加的動物膠原水解蛋白(<7h)。該方法的檢出限為9.00gg/mL。摻加1％的膠原水解蛋白就

6、可以檢測得到。此方法是目前最常采用的方法之一，但是它在檢測精度方面與HPLC法相比有很大的不足。該法適合于在企業(yè)實驗室使用。 2．離子交換色譜-積分脈沖安培法檢測牛乳中摻加的膠原水解蛋白本研究采用陰離子交換色譜-積分脈沖安培法檢測牛乳中摻加的動物膠原水解蛋白。由于膠原水解蛋白中含有高比例的羥脯氨酸，由測得的羥脯氨酸含量乘以7.65得到牛乳中摻加的膠原水解蛋白量。該法無需衍生處理，可直接對羥脯氨酸進行測定。 以AminoP

7、ac PAl0為色譜柱，流動相A：超純水(>18.2Q)，流動相B：0.25mol/L的NaoH，流動相C：1.0mol/L的NaAC。采用離子交換色譜-積分脈沖安培法測定牛乳中摻加的膠原水解蛋白，當Hyp在20～200nmol/L時具有良好的線性關系。結果表明該法具有較好的穩(wěn)定性(RSD小于3％)和較高的回收率(89.16％～100.48％)。此法的檢出限為1.0μg/mL。檢測精度高。分析可在42min內完成。 3．2，4-

8、二硝基氟苯柱前衍生反相高效液相法檢測牛乳中摻加的膠原水解蛋白本試驗采用2，4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生高效液相色譜法檢測牛乳中摻加的膠原水解蛋白。由于膠原水解蛋白中含有高比例的Hyp，由測得的羥脯氨酸的含量乘以7.73可以得到牛乳中摻加的膠原水解蛋白的量。 本試驗以symmetry-C18(150mm x3.9mm，i.d.5rma)為色譜柱，2，4-二硝基氟苯為衍生試劑，梯度洗脫。流動相A：0.05mol/L乙酸鈉緩沖溶