免疫學(xué)檢測(cè)羊乳中摻入牛乳成分的研究.pdf

1、乳品摻假現(xiàn)象的發(fā)生已經(jīng)對(duì)消費(fèi)者的健康與安全形成危害，造成公共衛(wèi)生問(wèn)題。本研究通過(guò)對(duì)抗原-酪蛋白的分離提取及免疫，獲得兔抗牛β-酪蛋白血清抗體；并進(jìn)一步研究抗體修飾技術(shù)對(duì)血清抗體的影響，建立定量檢測(cè)牛β-酪蛋白以及羊乳中摻入牛乳成分的免疫學(xué)方法。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下： 1、兔抗牛β-酪蛋白血清抗體制備與特性研究 牛β-酪蛋白抗原制備。采用尿素沉淀法從干酪素中分離β-酪蛋白作為抗原，獲得的β-酪蛋白(bovineβ-casein)，

2、純度為90.1％，得率為26.4％(w/w)。加入福氏佐劑作為免疫原。 血清抗體的制備。免疫新西蘭白兔，免疫五次后，采用頸動(dòng)脈放血法收集血液，經(jīng)4℃，4小時(shí)放置后，采集免疫血清。經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè)免疫血清的效價(jià)為1:10240。 通過(guò)飽和硫酸銨分級(jí)沉淀法純化免疫血清，得到兔抗牛β-酪蛋白血清抗體(IgGanti-bovineβ-casein，anti-BC)，其純度為84.2％。 血清抗體的特性。通過(guò)間接E

3、LISA分析，研究牛乳中常見(jiàn)的乳清蛋白、αs-、κ-酪蛋白和β-酪蛋白抗原與anti-BC的反應(yīng)特性，按親和力大小排序β-酪蛋白＞αs-酪蛋白＞κ-酪蛋白＞乳清蛋白。 2、抗體修飾技術(shù)的研究 血清抗體先經(jīng)過(guò)DEAE-SephadexA-50離子交換色譜純化，再通過(guò)抗體修飾技術(shù)(rendering)：將兔抗牛β-酪蛋白血清抗體(2.24mg/mL)和羊乳β-酪蛋白(2mg/mL)等體積混合于37℃培養(yǎng)2h，旨在消除血清抗體

4、中可以與羊乳β-酪蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)的抗體(又稱抗體堵住blocking)，以提高血清抗體的免疫反應(yīng)特異性。交叉反應(yīng)的抗體抗原(羊乳β-酪蛋白)復(fù)合物在后續(xù)的ELISA洗滌步驟中被去除。 采用間接ELISA通過(guò)抗原抗體的劑量反應(yīng)曲線比較修飾前后抗體的免疫反應(yīng)特異性，分別以脫脂牛乳、羊乳(均按1:23～1:211梯度稀釋)為包被抗原，修飾前后的抗體(anti-BC和blockedanti-BC)稀釋倍數(shù)為1:40。 結(jié)果顯示

5、，當(dāng)抗原稀釋倍數(shù)在1:23～1:28的范圍內(nèi)時(shí)，特別是當(dāng)抗原稀釋倍數(shù)為1:24時(shí)，anti-BC與脫脂羊乳的反應(yīng)值是blockedanti-BC與脫脂羊乳反應(yīng)值的2.50倍，而ami-BC與脫脂牛乳的反應(yīng)值只是blockedanti-BC與脫脂牛乳反應(yīng)值的1.01倍。 因此，與anti-BC反應(yīng)相比，blockedanti-BC對(duì)羊乳的親和力明顯降低，而抗體經(jīng)修飾處理前后，對(duì)于牛乳的親和力差別不大。當(dāng)抗原稀釋倍數(shù)在1：23～1:

6、28的范圍內(nèi)時(shí)，blockedanti-BC能夠有效地將牛乳與羊乳區(qū)分開(kāi)來(lái)。采用抗體修飾技術(shù)有效地封堵了血清抗體中與羊乳β-酪蛋白交叉反應(yīng)的抗體組分，提高了免疫反應(yīng)的專一性。為建立免疫學(xué)檢測(cè)羊乳中摻入牛乳成分的研究奠定了基礎(chǔ)。 3、間接ELISA檢測(cè)牛β-酪蛋白的方法建立及應(yīng)用。 通過(guò)棋盤滴定法，確定了β-酪蛋白抗原包被濃度1.25μg/mL，血清抗體(anti-BC)的最佳工作濃度1:1280，酶標(biāo)二抗的工作濃度1:1

7、000。建立的間接ELISA檢測(cè)牛β-酪蛋白的線性范圍是25～2500ng/mL，相關(guān)系數(shù)0.9663，變異系數(shù)(CV)小于5％，回收率在93.5％～127.0％。 證明所建立的間接ELISA檢測(cè)牛β-酪蛋白方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確度均能滿足檢測(cè)要求，并且方便易行：可以通過(guò)β-酪蛋白與牛乳中總蛋白質(zhì)的關(guān)系，用于牛乳及其產(chǎn)品的牛乳源性蛋白質(zhì)的快速免疫方法檢測(cè)，作為質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。 4、免疫學(xué)檢測(cè)羊乳中摻入牛乳含量的研究

8、 優(yōu)化了間接ELISA的檢測(cè)條件：包被脫脂牛乳、牛乳酪蛋白以及滅菌乳稀釋倍數(shù)1:128，1:32，1:128；分別加入經(jīng)抗體修飾技術(shù)處理后的抗體(blockedanti-BC)，稀釋度分別為：1:160，1:80，1:160，酶標(biāo)二抗的工作濃度1:1000。 建立了檢測(cè)羊乳樣品中摻入牛乳成分含量的間接ELISA方法。樣品為脫脂乳及滅菌乳的檢測(cè)線性范圍是2～50％(羊乳中摻入牛乳的質(zhì)量分?jǐn)?shù),V/V)，相關(guān)系數(shù)是0.999，最低檢

9、出量4％；樣品為乳酪蛋白的檢測(cè)線性范圍2～50％(w/w)，相關(guān)系數(shù)是0.98，最低檢出量3.5％。變異系數(shù)(CV)均小于5％。實(shí)驗(yàn)所建立的間接ELISA檢測(cè)羊乳樣品中摻入牛乳成分含量方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作便易等特點(diǎn)，可以用于針對(duì)羊乳中是否摻入牛乳、乳酪蛋白以及滅菌乳的快速檢測(cè)。 本課題從牛β-酪蛋白抗原制備開(kāi)始，完成了兔抗牛β-酪蛋白血清抗體的制備及特異性分析、抗體修飾技術(shù)對(duì)血清抗體影響的研究，建立了定量檢測(cè)牛β-