乙型肝炎病毒對核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)影響的研究.pdf

1、背景和目的:乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，我國是HBV的高流行地區(qū)，一般人群中流行率為7.18％，大概有9300萬慢性乙型肝炎患者。慢性HBV感染可以導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，甚至可發(fā)展為肝硬化及肝細(xì)胞癌，對患者造成極大危害。氧化應(yīng)激反應(yīng)是肝細(xì)胞炎癥壞死、纖維化甚至肝硬化及肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要機(jī)制之一。慢性HBV感染的肝細(xì)胞持續(xù)表達(dá)病毒蛋白可以引起肝細(xì)胞線粒體釋放過量的活性電子和活性氧自由基，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和DN

2、A損害，從而造成肝細(xì)胞的損傷。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2作為抗氧化應(yīng)激基因的調(diào)控者，在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中促進(jìn)多種抗氧化蛋白的合成而發(fā)揮重要作用，它激活多種抗氧化蛋白如NQO1，HO-1等，能夠減輕肝細(xì)胞所受的氧化損害。在對酒精性肝炎、非酒精脂肪肝、藥物性肝炎等的臨床研究發(fā)現(xiàn)Nrf2的上調(diào)可以減輕肝細(xì)胞所受的氧化應(yīng)激損害。但HBV對Nrf2表達(dá)影響的研究報道很少，并且作用機(jī)制也不清楚。
　　在本研究中，我們通過研究HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞

3、及慢性乙型肝炎患者肝組織，觀察HBV對Nrf2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，為慢性乙型肝炎病變機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:1.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:將HepG2細(xì)胞種植于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)培養(yǎng)皿70％時，分別用pcDNA和pHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后4小時更換培養(yǎng)基1次，繼續(xù)培養(yǎng)48小時收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):首先分別提取已經(jīng)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞的總RNA，測定RNA的濃度后取2ugRN

4、A，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，然后行Realtime PCR。
　　3.蛋白免疫印跡法:以β-actin為內(nèi)參照使用蛋白免疫印跡法檢測Nrf2蛋白的表達(dá)。
　　4.免疫組織化學(xué)法:用免疫組織化學(xué)方法檢測慢性乙型肝炎患者肝活檢病理組織中Nrf2蛋白的表達(dá)，并且觀察輕度、中度及重度炎癥壞死肝組織中Nrf2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.用RT-qPCR法檢測Nrf2 mRNA的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參照。結(jié)果表明HBV

5、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Nrf2 mRNA的相對表達(dá)量與空載體組和未轉(zhuǎn)染組表達(dá)相似，說明HBV對Nrf2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平無上調(diào)作用。
　　2.用Western blot法檢測Nrf2蛋白的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參照。結(jié)果表明HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組能夠表達(dá)HBx蛋白，空載體組和未轉(zhuǎn)染組無表達(dá)。說明HBV轉(zhuǎn)染組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功?？蛰d體組和未轉(zhuǎn)染組中Nrf2表達(dá)量基本一致，而HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Nrf2的表達(dá)量明顯高于前兩者。表明HBV可以上調(diào)Nrf2蛋白

6、的表達(dá)。
　　3.用免疫組織化學(xué)法檢測慢性乙肝患者肝活檢病理組織中Nrf2蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示慢性乙肝患者Nrf2蛋白的表達(dá)量明顯高于正常組。輕度炎癥壞死肝組織中Nrf2的表達(dá)量最高，中度炎癥壞死肝組織中Nrf2的表達(dá)量次之，重度炎癥壞死肝組織中Nrf2的表達(dá)量最低。說明HBV感染能夠上調(diào)慢性乙型肝炎患者肝組織Nrf2蛋白的表達(dá)，但是持續(xù)HBV感染可以下調(diào)Nrf2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:1.HBV表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至HepG2