恩度聯(lián)合mut1抗原特異DC-T細胞對Lewis肺癌小鼠的抗腫瘤效應研究.pdf

1、目的：
　　腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移都與腫瘤的的血管新生密不可分，因此抑制腫瘤的血管新生是控制腫瘤生長的新熱點。重組人血管內(nèi)皮抑素(恩度，Endostar)是通過抑制血管生長起抗腫瘤作用的一種藥物。研究證實單獨應用抗血管新生藥物不能帶來長期的生存獲益，而聯(lián)合細胞免疫治療可能獲得持續(xù)性的腫瘤消退，這提示抗血管新生藥物與細胞免疫治療有協(xié)同效應。樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是功能最強的專職抗原遞呈細胞(antige

2、n-presenting cells，APCs)，在調(diào)控機體固有和適應性免疫應答中起重要的作用，負載腫瘤抗原的樹突狀細胞是近年來被廣泛研究生物治療之一。本實驗通過C57BL/6小鼠Lewis肺癌荷瘤模型，研究恩度聯(lián)合負載mut1抗原特異的DC-T細胞的抗腫瘤效應及對腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫網(wǎng)絡的影響，進一步明確恩度聯(lián)合細胞免疫治療的抗腫瘤效應，從而為開展抗血管新生的分子靶向治療與細胞免疫治療的聯(lián)合提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法：

3、>　　1.培養(yǎng)Lewis肺癌細胞:顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)和數(shù)量，及時換液和傳代，待細胞生長進入對數(shù)期后，用于實驗。
　　2.制備負載mut1抗原多肽的DC-T細胞:分離及培養(yǎng)小鼠脾T淋巴細胞，分離及培養(yǎng)小鼠來源的樹突狀細胞，負載mut1抗原多肽的樹突狀細胞與T淋巴細胞共培養(yǎng)制備mut1抗原特異性的DC-T細胞。
　　3.構(gòu)建C57BL/6小鼠Lewis肺癌皮下種植瘤模型并分組:將C57BL/6小鼠荷瘤后隨機分為A組（PBS對照

4、組）、B組（DC-T組）及C組（DC-T+恩度組）。荷瘤后第7天開始給予治療干預:A組給予尾靜脈注射PBS溶液，B組及C組給予尾靜脈輸注負載mut1抗原肽DC-T細胞，C組給予尾靜脈注射恩度（重組人血管內(nèi)皮抑素）。
　　4.腫瘤生長情況及抑瘤率的測定:荷瘤后隔日測量各組小鼠體質(zhì)量及移植瘤的最大長徑和短徑，計算腫瘤體積并繪制生長曲線;末次干預24小時后處死小鼠，解剖出腫瘤組織稱其體質(zhì)量并計算抑瘤率。
　　5.免疫組化SP法檢測

5、各組腫瘤組織微血管密度(MVD)。
　　6.Western blotting檢測各組腫瘤組織中VEGF-A和HIF-1α的表達。
　　7.流式細胞術(shù)檢測腫瘤組織中MDSC、TAM(M1/M2)、mDC和CD8+T細胞的比例。
　　結(jié)果：
　　1.與A組相比，B組及C組小鼠體質(zhì)量及腫瘤體積增長緩慢，B組腫瘤質(zhì)量小于A組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，抑瘤率為25％;C組腫瘤質(zhì)量明顯小于A組，差異具有統(tǒng)計學意義

6、(P＜0.01)，抑瘤率為52％。
　　2.MVD計數(shù)統(tǒng)計結(jié)果示B組與A組相比MVD計數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);C組與A組相比MVD計數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　3.Western blotting結(jié)果顯示，與A組相比，B組(P＜0.05)及C組(P＜0.01)腫瘤組織內(nèi)的VEGF-A蛋白表達水平下降，HIF-1α蛋白表達水平增加
　　4.流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與A組相比，