轉(zhuǎn)染PF4cDNA的GRC-1細(xì)胞培養(yǎng)上清對于ECV-304細(xì)胞的生長及VEGF表達(dá)的抑制作用.pdf

1、Deutsch通過純化一種中和肝素抗凝血活性因子,并將其命名為PF4.PF4屬于細(xì)胞因子家族,是一種分子量為7.8kD的蛋白聚糖,由巨核細(xì)胞合成,以非共價(jià)四聚體的形式貯存在α顆粒中,由激活的血小板分泌.實(shí)驗(yàn)表明,人血小板因子4(PF4)具有較為明顯的抑制腫瘤血管生成的作用.其主要機(jī)制可能與減弱VEGF、bFGF,及金屬蛋白酶的促血管生長作用,并抑制p21基因的下調(diào)有關(guān).目的:該研究以含有hPF4 cDNA的重組載體轉(zhuǎn)染人的GRC-1細(xì)胞

2、,并觀察了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清對于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響,以及轉(zhuǎn)染并觀察了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清對于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響,以及轉(zhuǎn)染前后GRC-1細(xì)胞表達(dá)VEGF的變化.旨在揭示hPF4對于GRC-1細(xì)胞生長的抑制作用,為防治腎癌提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù).方法:1真核表達(dá)載體pcDNA3-PF4-SS的構(gòu)建及鑒定.將重組載體pEGFP-C1-PF4及質(zhì)粒pcDNA3-CD34-SS在BglⅡ和BamH Ⅰ內(nèi)切酶及T<,4>DNA連接酶的作用下,將酶

3、切下的hPF4 cDNA連接于載體pcDNA3-CD34-SS中,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3-PF4-SS,并用BglⅡ/BamH Ⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定.2.GRC-1細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及鑒定.取對數(shù)期生長的GRC-1細(xì)胞,通過脂質(zhì)體介導(dǎo),按lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒中的說明書,以該載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GRC-1細(xì)胞.挑選出抗G418陽性細(xì)胞,分別用400~1200mg/L 5個(gè)藥物濃度進(jìn)行篩選,當(dāng)藥物濃度達(dá)到1000μg/m1時(shí),對照組細(xì)

4、胞全部死亡,將轉(zhuǎn)染后的GRC-1細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng).根據(jù)hPF4基因的合成PCR引物.用RT-PCR對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定.3.轉(zhuǎn)染前后GRC-1細(xì)胞中VEGF表達(dá)的檢測.利用VEGF多克隆抗體對GRC-1-PF4及GRC-1細(xì)胞的細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,比較兩者表達(dá)的強(qiáng)弱水平.4.轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清對EVC304細(xì)胞生長的影響.取對數(shù)期生長的EVC304細(xì)胞,分成三組分別加入GRC-1-PF4,GRC-1細(xì)胞的培養(yǎng)上清及RPMI16