芍藥泛素和乙烯受體基因的克隆、分析及PlETR1煙草轉化.pdf

1、芍藥（Paeonia lactifloraPall.）為芍藥科芍藥屬花卉，是我國傳統(tǒng)名花。但是，芍藥與其它鮮切花一樣，會隨著花朵的開放迅速衰老。乙烯，作為一種植物激素，在植物生長和發(fā)育過程中起著重要作用，并調(diào)控花衰老?；ǘ湟蚁┧降脑黾优c花衰老相關。本研究克隆了芍藥品種‘桃花飛雪’的乙烯受體基因家族成員、分析其表達水平并進行了 PlETR1基因的煙草遺傳轉化。另外，本研究開發(fā)了一種新的PCR技術：引物池-隨機引物對PCR，使用該技術克隆

2、到7個芍藥泛素基因。研究結果如下：
　?。?）通過RT-PCR獲得芍藥3條乙烯受體基因相關序列，結合本實驗室在前期工作中借助RACE PCR技術獲得的1條乙烯受體基因相關序列，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)這4條非冗余序列編碼的多肽鏈分別為擬南芥AtETR1、AtETR2、AtERS1和AtEIN4的同源序列，因而將這4個推測的基因命名為 PlETR1、PlETR2、PlERS1和PlEIN4?？寺～@得的芍藥PlETR1、PlETR2、PlE

3、RS1和PlEIN4DNA片段長度分別為2817bp、2286bp、2016bp和2295bp，依次編碼740、761、633和764個氨基酸，核酸序列GenBank登錄號為JX406435、KP265306、KP265307和KP265308。生物信息學分析表明PlETR1、PlETR2和PlERS1的N端3次跨膜，PlEIN4的N端4次跨膜。結構域分析顯示這4個乙烯受體均具有GAF、HisKA和 HATPase_c3個典型的乙烯受體

4、結構域，PlETR1、PlETR2和PlEIN4具有REC結構域，而PlERS1無此結構域。
　　以芍藥花瓣不同發(fā)育時期表達最穩(wěn)定的Actin2作為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR技術分析這4個受體在芍藥開花指數(shù)1～6級時的花瓣中的表達水平，結果表明：芍藥乙烯受體的不同家族成員的表達模式和表達水平不同，PlETR1在1～5級花瓣中的表達模式呈“V”形，6級時仍然維持在較高水平；PlETR2在花瓣發(fā)育的6個階段表達量都很低；PlER

5、S1和PlEIN4在芍藥花發(fā)育的6個階段表達模式相似，在2級時的最低，6級時的最高，變化趨勢都是從1級時的較高水平先下降后上升，再下降，隨之上升到6級時的最高水平，整體的變化趨勢近似“W”形。不同乙烯受體的差異表達模式表明芍藥花瓣對乙烯具有復雜的響應機制。
　　（2）以cDNA為模板，擴增 PlETR1序列，將其連接到過表達載體pCambia1301-UbiN上并將重組載體導入農(nóng)桿菌，采用葉盤法轉化煙草。遺傳轉化的標記基因能夠代謝

6、潮霉素B，因而轉基因成功的植株具有潮霉素B抗性。農(nóng)桿菌侵染的煙草葉片接種到潮霉素選擇培養(yǎng)基上，將煙草葉片愈傷組織分化形成的幼苗種在蛭石-草炭土基質(zhì)中，幼苗長大后在DNA和RNA水平檢測目的基因。本研究通過PCR確定PlETR1已經(jīng)整合到煙草的基因組DNA上，并且借助RT-PCR確定PlETR1在煙草葉片中轉錄出RNA。
　?。?）IlluminaHiSeq?2000測序平臺獲得的Reads（直接測序獲得的序列）較短，很難對高同源性

7、多基因家族（如泛素基因家族）成員進行正確拼接。為了獲得正確且完整的編碼區(qū)序列（Coding sequence，CDS），可從轉錄組數(shù)據(jù)中分離含有5'和3'非編碼區(qū)（Untranslated region，UTR）的同一基因家族成員相關序列，在UTR區(qū)分別設計上下游引物F（Forward primer）和R（Reverse primer），將所有F混合在一起構成F池，所有R構成R池?；旌螰池和R池組成總引物池，理論上通過一次PCR就能將P

8、CR反應液中含有上下游引物的所有序列擴增出來，這樣的PCR可被稱為總引物池PCR（Totalprimed poolPCR，Total ppPCR）。做完總引物池PCR之后，將F池與R分別組合或R池與F分別組合，所執(zhí)行的PCR分別被稱為F池PCR（F-Pool PCR）和R池PCR（R-Pool PCR）。然后，將電泳后有條帶的F池和R池PCR對應的R與F隨機組合進行PCR（隨機引物對PCR，Arbitrarily primedpair

9、PCR，appPCR），再將擴增獲得的條帶回收并測序。引物池和隨機引物對PCR合稱為引物池-隨機引物對PCR（Primed poolandarbitrarily primedpairs PCR，pp-appPCR），該技術適用于克隆已獲得5'和3' UTR序列并且無法通過拼接得到完整CDS的情況，用于分離高同源性多基因家族成員。
　　從芍藥轉錄組數(shù)據(jù)中分離出12條含有5'UTR和11條含有3'UTR的泛素基因（Ubiquitin，

10、UBQ）序列，在UTR區(qū)設計引物，可組合成1個總引物池、12個R池和11個F池。隨機引物對PCR擴增出8條帶，將測序后的序列命名為UBQ1-UBQ8，生物信息學分析測序結果表明：UBQ3和UBQ8為同一序列且UBQ1至UBQ7兩兩間非冗余，7條序列均為泛素基因，含有完整CDS，其GenBank登錄號分別為KT203772.1、KP645374.1、KP708576.1、KP708577.1、KT203773.1、KP708578.1和K