乙烯利調(diào)控甘蔗基因的差異表達(dá)及甘蔗乙烯受體基因Sc-ERS的克隆研究.pdf

1、乙烯是一種結(jié)構(gòu)簡單的氣體植物激素，它對植物的代謝調(diào)節(jié)可貫穿其整個生活周期。前人的大量研究結(jié)果已證實(shí)，在甘蔗生長發(fā)育的前期，葉面噴施低濃度的乙烯利能有效促進(jìn)甘蔗早期的萌芽、分蘗和生長，增強(qiáng)光合作用，提高抗旱性等。為進(jìn)一步了解乙烯利調(diào)控甘蔗生長的分子作用機(jī)理，以便更好地利用乙烯利進(jìn)行甘蔗化學(xué)調(diào)控，本文對用乙烯處理的甘蔗前期基因差異表達(dá)進(jìn)行了分析，并對甘蔗乙烯受體Sc-ERS基因進(jìn)行了克隆、序列分析等方面的研究。 1．建立和優(yōu)化了一套

2、研究乙烯利調(diào)控甘蔗基因差異表達(dá)的cDNA-AFLP分析體系和銀染體系。結(jié)果表明：模板質(zhì)量的高低是cDNA-AFLP分析能否成功的關(guān)鍵。在甘蔗RNA提取中及時去除甘蔗組織可以降低多糖物質(zhì)的殘留；在RT-PCR反應(yīng)及cDNA第二鏈合成的操作中，適當(dāng)延長合成的時間有利于獲得更長、更完整的ds cDNA；在cDNA-AFLP分析中，確定初級模板預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)數(shù)20循環(huán)、反應(yīng)產(chǎn)物20倍稀釋液作為二級模板時選擇性擴(kuò)增效果較好；在銀染檢測過程中，使用

3、高純度的Na<,2>CO<,3>，并控制好凝膠漂洗和顯色時間可以獲得理想的檢測效果。利用cDNA-AFLP技術(shù)對乙烯利處理的甘蔗進(jìn)行基因差異表達(dá)研究，每個樣品的擴(kuò)增條帶數(shù)均在35-80之間，其中大多數(shù)在50-70范圍內(nèi)，處理和對照之間條帶多態(tài)性明顯。 2.對部分差異轉(zhuǎn)錄片段進(jìn)行了回收、克隆、反向Northern雜交驗(yàn)證、序列分析和功能分析等方面研究。研究結(jié)果表明：在反向Northern雜交實(shí)驗(yàn)中，24個測試樣品中有11個表現(xiàn)沒有

4、差異，假陽性率高達(dá)46％；在乙烯作用下，甘蔗的CHI、GST.ARP.LHG.核結(jié)合蛋白基因以及一批未知基因差異表達(dá)；其中CHI、GST、LHC和核結(jié)合蛋白是與促進(jìn)植物的抗病抗逆、提高光合作用等密切相關(guān)的因子。 3.根據(jù)已知乙烯受體基因的序列信息，設(shè)計(jì)了一對簡并引物和一對特異引物，對甘蔗葉片基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了一個甘蔗乙烯受體基因(Sc-ERS)的片段。序列分析表明，該片段大小為4310bp，包含一個由5個外顯子和

5、4個內(nèi)含子組成的4219bp大小的完整編碼區(qū)。Sc-ERS編碼區(qū)與玉米乙烯受體ERS1基因(AY359578)、水稻乙烯受體ERS1基因(AY043031)的編碼區(qū)同源率分別為91.4％和61.6％，推導(dǎo)Sc-ERS編碼的蛋白包含636個氨基酸殘基，與玉米乙烯受體基因、水稻乙烯受體基因所編碼蛋白的氨基酸同源率分別為94.1％和89.4％。對推導(dǎo)蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的結(jié)果顯示Sc-ERS編碼的蛋白和玉米、水稻ERSI所編碼的蛋白一樣，在N段