甘蔗部分磷素響應(yīng)關(guān)鍵基因的克隆及表達分析.pdf

1、磷素作為甘蔗生長發(fā)育的必需肥料元素之一，在甘蔗生長發(fā)育的各個階段起著至關(guān)重要的作用，如適量施磷不僅可以促進甘蔗根、莖、葉等組織器官的形態(tài)建成，而且可以有效改善甘蔗莖徑、有效莖數(shù)、單莖重，進而貢獻于甘蔗產(chǎn)量的增加。研究者們對我國多個蔗區(qū)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，大部分蔗區(qū)的有效磷含量仍處于中等以下水平，且蔗區(qū)的磷素利用效率也相對低下，僅為6.7％-15.3%。近年來，人們通過對一些模式植物擬南芥、水稻進行研究發(fā)現(xiàn)，通過分子手段進行磷高效種質(zhì)材料的改良

2、、創(chuàng)新可大大改善植物自身磷素利用率過低這一現(xiàn)狀。
　　本研究以轉(zhuǎn)錄組測序建立的unigene數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，對其中參與甘蔗磷素響應(yīng)調(diào)控基因進行發(fā)掘。并以轉(zhuǎn)錄組測序所獲序列為模板，設(shè)計特異性克隆引物，對其中的部分關(guān)鍵基因完成克隆和表達模式分析。旨在揭示甘蔗磷素響應(yīng)調(diào)控過程的相應(yīng)基因，為下一步進行磷高效甘蔗種質(zhì)創(chuàng)新和篩選鑒定奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果與結(jié)論如下：
　　1.應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序建立的unigene數(shù)據(jù)庫對甘蔗磷素響應(yīng)調(diào)控基因完成注

3、釋，從中我們共注釋出130條unigene信息，它們分別編碼甘蔗的ScPHR1-3（7條）、ScSPX1-6（12條）、ScPAP2（4條）、ScPHT1（13條）、ScPHO1;1-1;3（5條）等75個基因。
　　2.應(yīng)用PCR克隆手段對其中注釋為甘蔗的ScPHR1-3、ScSPX1-6完成克隆?？寺〗Y(jié)果顯示，甘蔗的ScPHR1基因cDNA序列全長1539bp，編碼442個氨基酸；ScPHR2基因cDNA序列全長1520bp，

4、編碼417個氨基酸；ScPHR3基因cDNA序列全長1351bp，編碼393個氨基酸；ScSPX1基因cDNA序列全長1639bp，編碼310個氨基酸；ScSPX2基因cDNA序列全長2050bp，編碼278個氨基酸；ScSPX3基因cDNA序列全長892bp，編碼259個氨基酸；ScSPX4基因cDNA序列全長1893bp，編碼336個氨基酸；ScSPX5基因cDNA序列全長889bp，編碼262個氨基酸；ScSPX6基因cDNA序列

5、全長1533bp，編碼260個氨基酸。
　　3.ScPHR1-3及ScSPX1-6基因編碼蛋白一級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，它們均屬于親水性，不穩(wěn)定蛋白。等電點預(yù)測分析，除ScSPX3蛋白呈堿性外，其余的均呈現(xiàn)酸性。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，ScPHR1-3均屬于 MYB-CC基因家族，有且都包含有 MYB-DNA結(jié)合域和Coil-colied(CC)結(jié)合域；ScSPX1-6均屬于SPX大家族,且都含有一個SPX結(jié)構(gòu)域。同源比對和遺傳進化分析結(jié)

6、果表明，甘蔗與高粱有著較近的遺傳關(guān)系，其次是玉米、水稻等。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，甘蔗ScPHR1-3及ScSPX1-6蛋白均不含跨膜結(jié)構(gòu)；且在功能預(yù)測結(jié)果呈現(xiàn)一致性，均為轉(zhuǎn)運和錨定。上述預(yù)測結(jié)果與水稻、擬南芥等植物分離出的該基因特征極為相似。
　　4.以甘蔗的根、莖、葉、芽為組織材料，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)對甘蔗ScPHR1-3、ScSPX1-6基因組織特異性表達進行分析。結(jié)果顯示，甘蔗的這9個基因在甘蔗的不同組織部位中均有表

7、達。對PHR基因家族表達特征具體分析發(fā)現(xiàn)，ScPHR1在根中的表達量最低，其次是莖、葉、芽；ScPHR3基因在莖中的表達量最低，其次是根、葉、芽；ScPHR2在根中的表達量最低，其次是莖、芽、葉。而對SPX基因家族分析顯示，其中除ScSPX6在芽中的表達量最低外，其余的基因均在根中的表達量為最低。除ScSPX1在葉中的表達量最高外，其余的均在莖中的表達量最高。
　　5.對甘蔗ScPHR1-3基因亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，該基因家族中的S

8、cPHR1和ScPHR2定位于煙草表皮細胞的細胞核內(nèi)，ScPHR3定位于煙草表皮細胞的細胞膜和細胞質(zhì)上。對ScSPX1-6基因亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，ScSPX1和ScSPX2定位于煙草表皮細胞的細胞核內(nèi)；ScSPX3和ScSPX6定位于煙草表皮細胞的細胞膜和細胞質(zhì)上；ScSPX4和ScSPX5定位于煙草表皮細胞的細胞膜和細胞核上，且ScSPX5在細胞質(zhì)中也有所表達。結(jié)合結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測分析，ScPHR1和ScPHR2，ScSPX1和ScSP

9、X2基因可能參與細胞核內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和錨定，而其他基因在這一特征上均呈現(xiàn)為多樣性，如它們均在細胞膜上有表達，表明它們可能參與細胞膜內(nèi)外的轉(zhuǎn)運和錨定，且ScSPX3、ScSPX5、ScSPX6還在細胞核內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，表明它們還可能參與細胞內(nèi)核質(zhì)間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運與錨定。此外，ScPHR3、ScSPX4與ScSPX5在胞質(zhì)中也存在有一定的表達，因此，我們推測它們還可能參與細胞器間物質(zhì)的交流。
　　6.原核表達分析結(jié)果表明，這9個基因在18℃用0.