2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、甘蔗(Saccharum officinarum)是最主要的糖料作物,而甘蔗黑穗?。⊿porisorium scitamineu)是我國蔗區(qū)最嚴重的一種氣傳真菌病害,嚴重影響甘蔗產(chǎn)量和糖分產(chǎn)量。目前普遍認為,以甘蔗抗黑穗病品種取代感病品種是防治黑穗病最經(jīng)濟有效的措施。但是,由于甘蔗遺傳背景復雜,甘蔗優(yōu)良基因型重組概率低至1/300,000,單純依靠傳統(tǒng)雜交和系圃選擇的途徑來培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病兼具的優(yōu)良品種難度大。通過挖掘甘蔗抗病基因,

2、一方面可以為轉(zhuǎn)基因改良提供優(yōu)異基因資源,另一方面還可以為進一步開發(fā)抗病標記輔助選擇技術奠定基礎。植物幾丁質(zhì)酶(Chitinase)是一種典型的病程相關蛋白,已經(jīng)成為作物抗真菌病害的研究熱點之一。它能夠降解真菌細胞壁的重要成分—幾丁質(zhì),抑制真菌生長,從而提高植物對病原真菌的防御能力。鑒于此,進行甘蔗幾丁質(zhì)酶家族基因的分離與鑒定對甘蔗抗真菌性病害的聚合育種具有重要意義。
  本研究通過同源克隆法,從甘蔗中分離獲得4個幾丁質(zhì)酶家族基因的

3、全長cDNA序列。而后,應用生物信息學軟件,對基因所編碼的蛋白結構和功能進行預測分析。同時,采用實時熒光定量PCR技術,研究了甘蔗幾丁質(zhì)酶基因在甘蔗上的組織表達特性及其響應甘蔗黑穗病病原菌、信號因子和環(huán)境脅迫的表達模式。并進一步利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法,將幾丁質(zhì)酶基因?qū)肽J街参餆煵荩∟icotiana tabacum)中,研究基因過表達的效應。研究結果為揭示甘蔗幾丁質(zhì)酶家族基因的功能鑒定及及在甘蔗抗逆育種上的應用奠定基礎。主要研究結果與結

4、論如下:
  1.甘蔗幾丁質(zhì)酶家族基因cDNA全長序列克隆與分析
  采用同源克隆法,根據(jù)高粱基因組數(shù)據(jù)庫中的假定幾丁質(zhì)酶基因序列,設計特異性引物,利用RT-PCR技術,克隆獲得4個甘蔗幾丁質(zhì)酶家族基因cDNA序列,其中3個以甘蔗基因型崖城05-179接種黑穗病菌后48h樣品為模板獲得的,命名為:ScChiⅣ1、ScChiⅦ1和ScChiⅦ2,序列長度依次為:906bp、907bp和1,005bp,ORF分別為813bp、9

5、00bp和990bp。GenBank登錄號分別為:KF664178、KF279662和KF664179;以崖城05-179組培苗4℃處理24h后的樣品為模板,克隆獲得1個幾丁質(zhì)酶家族基因,命名為ScChiⅠ1,長度1,085bp,ORF為978bp,GenBank登錄號為KF664182。序列分析表明,上述4個基因序列的一致性介于22.7%-62.5%之間,其編碼蛋白與其他植物來源的幾丁質(zhì)酶氨基酸序列同源性較高,分別屬于幾丁質(zhì)酶家族Cl

6、assⅠ、ClassⅣ和ClassⅦ(ScChiⅦ1和ScChiⅦ2)。3個類型的幾丁質(zhì)酶基因在核苷酸、氨基酸序列和結構域上存在顯著差異。
  2.甘蔗幾丁質(zhì)酶基因的表達模式分析
  熒光定量檢測結果表明,4個甘蔗幾丁質(zhì)酶基因在蔗芽、葉、蔗髓和蔗皮中均有表達,屬組成型表達,但ScChiⅠ1在葉和蔗皮中表達量最高,ScChiⅣ1在葉中表達量最高,ScChiⅦ1和ScChiⅦ2在蔗芽中表達量最高。所克隆的4個ScChi對甘蔗黑穗

7、病菌脅迫響應的表達模式存在甘蔗基因型差異,其中ScChiⅠ1和ScChiⅦ1在抗病和感病基因型中表現(xiàn)一致。表現(xiàn)在:在抗病基因型崖城05-179中,ScChiⅠ1的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高,但ScChiⅣ1、ScChiⅦ1和ScChiⅦ2的轉(zhuǎn)錄水平卻呈現(xiàn)出明顯下降的趨勢,說明ScChiⅠ1正響應黑穗病菌脅迫,但其余3個基因則為負響應;在基因型―ROC22中,接種后24h,ScChiⅠ1、ScChiⅣ1和ScChiⅦ2的轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)顯著上升趨勢,

8、但ScChiⅦ1轉(zhuǎn)錄水平則明顯下降,說明ScChiⅠ1在感病基因型中也正響應黑穗病菌脅迫,而ScChiⅦ1依然為負響應。甘蔗幾丁質(zhì)酶基因?qū)π盘栁镔|(zhì)(水楊酸、茉莉酸甲酯、脫落酸)和環(huán)境(干旱、NaCl、重金屬和低溫)脅迫的應答反應不同。受水楊酸(Salicylic acid,SA)、茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)、脫落酸(Abacisic acid,ABA)脅迫后,ScChiⅠ1轉(zhuǎn)錄本水平均呈現(xiàn)顯著上升趨勢;Sc

9、ChiⅣ1基因表達受MeJA和ABA顯著誘導,但受SA的顯著抑制;受ABA脅迫后,ScChiⅦ1轉(zhuǎn)錄本水平呈現(xiàn)上升的趨勢,受MeJA和SA脅迫后,ScChiⅦ1表達水平呈現(xiàn)下降的水平;受SA、MeJA、ABA脅迫后,ScChiⅦ2轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降,并呈現(xiàn)全程抑制趨勢。受干旱(PEG)、NaCl和重金屬(CuCl2)脅迫后,ScChiⅠ1轉(zhuǎn)錄本水平呈現(xiàn)顯著上升,但低溫(4℃)卻抑制ScChiⅠ1的轉(zhuǎn)錄;上述環(huán)境脅迫顯著提高了ScChiⅣ

10、1基因的轉(zhuǎn)錄,且呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢;除低溫(4℃)外,ScChiⅦ1的轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)下降趨勢;除NaCl脅迫外,在脅迫后24h,ScChiⅦ2的表達量明顯提高。上述結果說明,甘蔗幾丁質(zhì)酶家族基因具有多樣性的功能。
  3.亞細胞定位分析
  利用農(nóng)桿菌介導法,將帶有不同目的基因ScChi(ScChiⅠ1、ScChiⅣ1或ScChiⅦ2)的植物亞細胞定位載體質(zhì)粒pCAMBIA-2300-ScChi-GFP滲透導入煙草葉片,顯微鏡

11、下觀察到pCAMBIA-2300-ScChiⅦ2-GFP重組蛋白的熒光信號定位于細胞核和細胞質(zhì)。
  4.ScChiⅠ1基因的原核表達分析
  成功構建了帶有ScChiⅠ1基因的原核表達載體pET32a-ScChiⅠ1,經(jīng)IPTG誘導,在大腸桿菌(E. coli)表達菌株BL21細胞中,得到目的融合蛋白,分子量為52.5kDa,為該基因編碼蛋白的體外抑菌活性驗證奠定基礎。
  5.ScChiⅦ2基因瞬時表達分析

12、  構建了植物超表達載體pCAMBIA-1301-ScChiⅦ2,其在煙草葉片中的瞬時表達結果顯示,二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)染色顏色加深和電導率增加,表明H2O2的積累,說明ScChiⅦ2引起植物過敏反應。
  6.甘蔗幾丁質(zhì)酶基因遺傳轉(zhuǎn)化煙草研究
  構建植物超表達載體pCAMBIA-1301-ScChiⅠ1/ScChiⅣ1/ScChiⅦ2,通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草的葉盤,獲得18株PCR檢

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