中國(guó)南方人群α-地中海貧血東南亞缺失型(-SEA)等位基因受到近代自然選擇作用的證據(jù).pdf

1、背景與目的:
　　 α-地中海貧血是世界上最常見(jiàn)的單基因遺傳病之一。其分子基礎(chǔ)是人α-珠蛋白基因發(fā)生突變導(dǎo)致對(duì)應(yīng)的珠蛋白鏈合成不足，使得血紅蛋白的α鏈和非α鏈比例失衡。目前已知的α-地中海貧血突變以大片段缺失為主，僅有少部分是由于點(diǎn)突變導(dǎo)致的。根據(jù)一條染色體上α基因的缺失數(shù)目，可分為α0-地中海貧血(——)和α+-地中海貧血(-α)兩種。α0突變雜合攜帶者（——/αα）表現(xiàn)出一定程度的貧血癥狀，而純合（——/——）則導(dǎo)致嚴(yán)重的致

2、死性疾病，胎兒無(wú)法存活。其中，東南亞缺失型（——SEA）是最常見(jiàn)的一種α0突變，其缺失片段內(nèi)包含了Ψα2，Ψα1，α2，α1和θ基因，全長(zhǎng)約為20.5kb?！猄EA主要分布在東南亞地區(qū)的泰國(guó)，菲律賓，越南和中國(guó)南部部分地區(qū)。前期的流行病調(diào)查顯示，我國(guó)南方的廣西和廣東地區(qū)——SEA突變的攜帶率分別為7.84％和4.14％。
　　 ——SEA突變的區(qū)域分布性和其在地區(qū)內(nèi)的高攜帶率這一現(xiàn)象的產(chǎn)生，一直以來(lái)都被認(rèn)為與其它常見(jiàn)的血紅蛋白

3、變異一樣，是受到瘧疾的自然選擇作用。例如，鐮刀形貧血癥(HbS)、血紅蛋白E(HbE)、血紅蛋白C(HbC)和β地貧CD41/42突變均從流行病調(diào)查數(shù)據(jù)和/或單倍型分析等方面提供了有說(shuō)服力的證據(jù)。意外的是，對(duì)包括——SEA在內(nèi)的α0-地貧突變與瘧疾和自然選擇作用之間的關(guān)系卻一直缺少證據(jù)支撐，未見(jiàn)有相關(guān)的群體遺傳學(xué)和分子進(jìn)化領(lǐng)域方面的報(bào)道。隨著HapMap，SGVP等群體變異數(shù)據(jù)計(jì)劃的完善，以及各種快速低廉的DNA變異分型技術(shù)的出現(xiàn)，以基

4、因組上的多態(tài)位點(diǎn)信息在群體遺傳學(xué)水平上探討自然選擇壓力在攜帶特定變異的染色體上留下的印記成為一種方便且可靠的方法。
　　 本研究擬通過(guò)對(duì)中國(guó)南方人群的——SEA缺失突變相關(guān)樣本的群體遺傳學(xué)研究，采用基于單倍型分析的方法，檢測(cè)自然選擇壓力作用于——SEA缺失在基因組上留下的痕跡，為——SEA是否受到瘧疾的自然選擇提供證據(jù)，以填補(bǔ)該遺傳疾病在分子進(jìn)化研究領(lǐng)域的空白，為其它類似疾病的研究提供一定的參考。
　　 材料與方法:

5、r>　　 研究樣本為來(lái)自中國(guó)南方廣東廣西兩個(gè)地區(qū)的214個(gè)個(gè)體。其中——SEA攜帶者76人，正常個(gè)體138人。由于樣本并非按照自然攜帶率采集，我們通過(guò)隨機(jī)數(shù)表，從攜帶者中選取23人與正常個(gè)體一起組成一個(gè)攜帶率為7％的人工隨機(jī)樣本（Constructed Random Samples，CRS），并且后續(xù)的部分分析在兩個(gè)樣本集合中都進(jìn)行。
　　 研究范圍是通過(guò)引入HapMap計(jì)劃中的北京漢族人群(Han Chinese in Be

6、ijing，CHB)作為參考確定的。掃描16號(hào)染色體的起點(diǎn)至——SEA缺失段下游約300kb范圍內(nèi)的常見(jiàn)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，我們篩選出25個(gè)標(biāo)簽SNP，另外再加上本實(shí)驗(yàn)室前期研究所得到的3個(gè)SNP，共28個(gè)SNP納入研究。這28個(gè)SNP覆蓋的基因組范圍約410kb。通過(guò)提取樣本的外周血DNA，對(duì)這些SNP進(jìn)行分型。步驟如下:先在10-20個(gè)的小樣本集合中采用測(cè)序確定

7、基因型，以此為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)大樣本使用高分辨率熔解曲線（High-Resolution Melt，HRM）技術(shù)進(jìn)行分型。
　　 分型結(jié)果通過(guò)Hwsim軟件進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)（Hardy-Weinberg Equilibrium Test， HWE），該檢驗(yàn)使用自由度為1的卡方檢驗(yàn)和蒙特卡洛置換檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。之后使用Phase2.1軟件對(duì)這28個(gè)SNP和——SEA變異位點(diǎn)進(jìn)行單倍型推斷。在推斷得到的單倍型基礎(chǔ)上做如下

8、分析:首先運(yùn)用Haploview4.2軟件進(jìn)行連鎖不平衡(Linkage Disequilibrium， LD)分析，計(jì)算并繪制連鎖不平衡圖譜，查看缺失突變與周圍多態(tài)位點(diǎn)的連鎖模式;運(yùn)用Sweep軟件對(duì)樣本進(jìn)行長(zhǎng)單倍型分析（Long-Range Haplotype Test，LRH test），檢驗(yàn)攜帶——SEA的染色體是否存在正性選擇作用的痕跡，并對(duì)——SEA突變出現(xiàn)的時(shí)間做粗略的年代估算;運(yùn)用R軟件分別通過(guò)bootstrap過(guò)程推斷

9、突變?nèi)旧w和正常染色體在研究區(qū)段內(nèi)各個(gè)部分的最小重組事件(Minimum Number of Recombination Events，RM)參數(shù)，用以判斷連鎖程度的增加是否來(lái)源于大片段缺失引起的缺失段內(nèi)重組事件消失的影響;最后運(yùn)用Network4.6.1.0軟件對(duì)樣本單倍型進(jìn)行了中介網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建，用以分析單倍型之間的親緣關(guān)系。
　　 通過(guò)上述各個(gè)分析結(jié)果的綜合總結(jié)和討論，可以對(duì)——SEA缺失是否受到瘧疾的自然選擇作用做出一個(gè)較有

10、說(shuō)服力的推測(cè)。
　　 結(jié)果與討論:
　　 28個(gè)SNP位點(diǎn)中，除了一個(gè)位點(diǎn)rs216091外(x2=4.66，P=0.031)，其余的SNP在CRS群體中均符合Hardy-Weinberg平衡。通過(guò)對(duì)部分樣本二次測(cè)序排除了分型錯(cuò)誤的可能。通過(guò)對(duì)攜帶者組和正常人組的等位基因頻率比較，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)在正常人中次要等位基因(Minor Allele Frequency，MAF)很低的多態(tài)位點(diǎn)（rs3760053和rs77308790

11、）在攜帶者組中頻率很高，提示可能存在有由于自然選擇作用而引起的搭車效應(yīng)(hitchhiking)。
　　 對(duì)CRS樣本進(jìn)行的連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，雖然在缺失段下游約70kb處存在有重組熱點(diǎn)區(qū)，導(dǎo)致研究區(qū)段內(nèi)重組熱點(diǎn)區(qū)上下游的SNP位點(diǎn)之間、重組熱點(diǎn)區(qū)內(nèi)部SNP之間的連鎖程度很低。但是——SEA缺失與重組熱點(diǎn)區(qū)之后的SNP仍保持較高程度的連鎖，例如，丨D'丨與LOD值顯示，——SEA缺失與下游相距約250kb的rs1698232強(qiáng)連

12、鎖且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(丨D'丨=0.76，LOD=2.13)?？紤]到亞洲人群基因組內(nèi)的強(qiáng)連鎖很少出現(xiàn)在相距80kb以上的兩個(gè)SNP之間，這一距離遠(yuǎn)小于——SEA缺失等位基因與重組熱點(diǎn)區(qū)之后連鎖的SNP的距離。另外，前面提到的兩個(gè)SNP與——SEA缺失的連鎖模式相似，進(jìn)一步證明可能存在有搭車效應(yīng)。
　　 值得注意的是，在本研究中連鎖不平衡程度的增加的可能原因除了自然選擇作用外，也有可能是由于大片段缺失區(qū)域內(nèi)存在有重組較為活躍的區(qū)域而

13、使缺失染色體的重組比正常染色體少。為了驗(yàn)證這一可能性，我們比較攜帶——SEA缺失染色體和正常染色體的最小重組事件，分別考慮缺失段上下游區(qū)域的最小重組事件，采用bootstrap方法，得到兩組染色體RM差值的頻數(shù)分布，通過(guò)95％分位數(shù)指標(biāo)比較，我們認(rèn)為正常染色體的值均遠(yuǎn)大于突變?nèi)旧w（上游:7＞5;下游:9＞2，7，9是實(shí)際的RM差值，5和2是boostrap方法所得差值的95％分位數(shù)）。另外，考察HapMap人群數(shù)據(jù)，在缺失段內(nèi)的區(qū)域也

14、并未發(fā)現(xiàn)有重組熱點(diǎn)區(qū)。兩者都在一定程度上說(shuō)明了突變?nèi)旧w的連鎖程度高不是或不完全是大片段的缺失導(dǎo)致突變?nèi)旧w缺失段內(nèi)的重組減少引起的。
　　 LRH檢驗(yàn)在所有樣本群體和CRS樣本群體中均表明，攜帶——SEA缺失的染色體存在有陽(yáng)性選擇的標(biāo)志，通過(guò)引入SGVP計(jì)劃的中國(guó)人群CHS(Han Chinese in Singapore)做參照對(duì)16號(hào)染色體做LRH檢驗(yàn)，可得到具有相似次要等位基因頻率(MAF)在0.35cM出的REHH頻數(shù)

15、分布，通過(guò)95％分位數(shù)指標(biāo)比較分別得P＜0.004（全樣本）和P＜0.032(CRS)，證明本研究樣本所得的高REHH值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，通過(guò)LRH的結(jié)果對(duì)突變進(jìn)行粗略年代估算得到——SEA大約起源于3200年前，與瘧疾的流行時(shí)間大致吻合，也于其它已證明的具有抗瘧作用的變異出現(xiàn)時(shí)間相當(dāng)（約5000-10000年或更少）。
　　 以——SEA突變等位基因及其下游的7個(gè)SNP構(gòu)建的中介網(wǎng)絡(luò)圖顯示，該突變?cè)谥袊?guó)南方人群中來(lái)源于單一