中國南方人群β-地中海貧血CD41-42（-CTTT）突變的起源與擴(kuò)散的群體遺傳學(xué)研究.pdf

1、背景與目的： β-地中海貧血(β-thalassemia，簡稱β-地海)是全球最常見、對人類健康危害最大的單基因遺傳病之一，其分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)是由于β-珠蛋白基因缺陷，導(dǎo)致血紅蛋白分子中β-珠蛋白肽鏈的合成減少或缺如，從而引起血紅蛋白的α/β珠蛋白肽鏈比例失衡，進(jìn)而導(dǎo)致血紅蛋白不穩(wěn)定、紅細(xì)胞破壞而產(chǎn)生以溶血性貧血為主的癥狀群，在臨床上表現(xiàn)為輕重不等的慢性進(jìn)行性溶血性貧血。β-地貧是我國長江以南各省區(qū)人群中發(fā)生率最高、危害最為嚴(yán)重的

2、遺傳病之一，其中尤以廣西、廣東、海南等地發(fā)生率為甚，廣西和廣東人群攜帶率分別為4.8％~6.78％和2.54％~3.36％，海南人群的攜帶率估計(jì)約為2.7％，而海南黎族人群高達(dá)8‰~11.6％。 流行病學(xué)、遺傳學(xué)和體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，人類β珠蛋白基因是受瘧疾選擇作用最明顯的基因之一。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，β珠蛋白基因常見的變異HbS(β6Glu→Val)、HbC(βGlu→Lys)和HbE(β26Glu→Lys)以及β-地貧主

3、要分布在非洲、地中海地區(qū)、中東、東南亞和中國南方等熱帶、亞熱帶地區(qū)，與瘧疾的流行區(qū)域基本一致。細(xì)胞學(xué)和流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，血紅蛋白病HbS、HbC、HbE以及β-地貧的個(gè)體和紅細(xì)胞均具有抵抗瘧原蟲感染和降低惡性瘧嚴(yán)重程度的作用。最近對β-珠蛋白基因簇單核苷酸多態(tài)性的連鎖不平衡及單體型的分析發(fā)現(xiàn)，HbS、HbC和HbE的發(fā)生可能是人類進(jìn)化史上近5000年內(nèi)獨(dú)立發(fā)生的事件，提示人類β珠蛋白基因變異與瘧疾選擇作用密切相關(guān)。由于瘧疾流行區(qū)人群中雜

4、合子優(yōu)勢具有保護(hù)人類免患瘧疾或減緩惡性瘧嚴(yán)重程度的作用。因此，這些具有選擇優(yōu)勢的基因在瘧疾發(fā)生地人群中的高頻率有利于人類抵抗瘧疾感染而得以生存和繁衍。 β-地貧的基因突變具有高度的異質(zhì)性，不同種族人群擁有自己一組獨(dú)特的β-地貧基因突變譜，表現(xiàn)為明顯的地域性或群體特異性。到目前為止，在我國南方人群中至少已發(fā)現(xiàn)36種β地貧突變類型。其中，常見的突變基因主要有8種，包括CD41-42(-CTTT)、IVS-2-654C→T、CD71-

5、72(+A)、CD17A→T、-28A→G。CD26G→A(HbE)、-29A→G和CD43G→T突變，分布在我國東南和西南等南方地區(qū)的人群中。值得注意的是，我國人群的β-地貧基因突變類型中，C041-42(-CTTT)缺失是一種最常見和分布最廣泛的突變，在我國南方各省人群中，該突變約占地貧突變的40％，而黎族人中β地貧基因突變幾乎全為C041-42(-CTTT)突變。我們最近的研究說明基因轉(zhuǎn)換(geneconversion)可能是人群

6、中CD41-42(-CTTT)突變擴(kuò)散的主要分子機(jī)制。對于特定人群來說，常見和廣泛分布的突變往往與其歷史和種群變遷相關(guān)，因此，可以通過遺傳病突變來追朔其建立者或祖先，進(jìn)而闡述人群起源和進(jìn)化史，這也是目前國際上分子進(jìn)化研究的前沿課題。 壯族是我國人口最多的少數(shù)民族，主要聚居在廣西壯族自治區(qū)的南部和中西部地區(qū)，源于古代百越的一支-璐越和甌越，是我國歷史上民族的主體很少遷徙的民族之一。黎族被認(rèn)為是海南的土著民族，其先民也源于駱越，在海

7、南島至少有3000年以上的歷史，與我國南方屬漢藏語系的操壯侗語族諸語言的壯族、侗族、水族、傣族、布依族等民族有密切的淵源關(guān)系。盡管β珠蛋白基因CD41-42(-CTTT)突變是包括壯族和黎族人群在內(nèi)的我國南方地區(qū)人群中最常見的β-地貧突變，但是，該突變何時(shí)出現(xiàn)?在黎族人群遷徙至海南前出現(xiàn)還是遷徙至海南后出現(xiàn)?在起源上，黎族、壯族和漢族人群的CD41-42(-CTTT)之間有何關(guān)系?是否與瘧疾選擇作用存在相關(guān)性?黎族人群為什么有如此高的攜

8、帶率?到目前為止尚未有確切的分子遺傳學(xué)依據(jù)。本研究根據(jù)壯族和黎族密切的歷史淵源關(guān)系以及黎族在海南有史可證的時(shí)代背景，選擇在廣西和海南當(dāng)?shù)厝巳褐蠧D41-42(-CTTT)這一最常見的β-地貧突變?yōu)閷ο?，通過群體遺傳學(xué)分析來闡述中國南方人群中這一具有選擇優(yōu)勢的致病突變的起源與擴(kuò)散，并企圖解釋人群自然選擇的分子進(jìn)化機(jī)制。 材料與方法： 1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品：在海南島采集2291例黎族人隨機(jī)樣品，在廣西地區(qū)采集1627例壯族人隨

9、機(jī)樣品，用于當(dāng)?shù)厝巳旱摩?地貧基因頻率調(diào)查。以隨機(jī)數(shù)方式分別從上述海南2291例黎族人和廣西1627例壯族人中選出201例黎族人和354例壯族人樣品，并分別采集海南島黎族人居住地的200例漢族人隨機(jī)樣品和廣西地區(qū)壯族人居住地的262例漢族人樣品，用于中國南方人群β-地貧CD41-42(-CTTT)突變的分子進(jìn)化研究。血液學(xué)參數(shù)和血紅蛋白A2定量用于篩查樣品中的β-地貧攜帶者，DNA診斷技術(shù)用于進(jìn)行β-地貧攜帶者突變的分子診斷。經(jīng)突變分析

10、確診，并在上述二地的四組樣品中排除了其他類型的β-地貧突變樣品后，核準(zhǔn)用于群體遺傳學(xué)分析的樣品合計(jì)907例，分別為：海南黎族人201例，海南漢族人200例，廣西壯族人280例和廣西漢族人226例。此外，我們還采集了8例β-地貧CD41-42(CTTT)純合子患者樣品用于本研究，分別為海南黎族人1例，海南漢族人3例、廣西漢族人2例和廣東漢族人2例。 2.方法：用鹽析法或磁珠法提取外周血白細(xì)胞DNA。用全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(FBC)和HbA

11、2含量測定篩查β-地貧攜帶者；用等位基因特異PCR和反向點(diǎn)雜交診斷41-42(-CTTT)突變。用PCR擴(kuò)增β-珠蛋白全長基因及其周圍序列(3.5kb片段)，用雙向核苷酸序列測定分析β-珠蛋白基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。用基因記數(shù)方法計(jì)算出各個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率，用x2檢驗(yàn)進(jìn)行基因型Hardy-Weinberg平衡吻合度和各人群的SNP等位基因頻率比較，用Fisher's確切概率法檢測各個(gè)人群之間的各種CD41-42(

12、-CTTT)單倍型的頻率有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。計(jì)算各個(gè)人群的單核苷酸多態(tài)性雜合度，用方差分析比較各個(gè)人群單核苷酸多態(tài)性雜合度的差異，并計(jì)算人群的分化指數(shù)，分析各個(gè)人群之間β-珠蛋白基因遺傳結(jié)構(gòu)的分化情況。用Phase2.1.1軟件進(jìn)行單倍型分析，用x2檢驗(yàn)進(jìn)行各個(gè)人群單倍型頻率的比較。用DnaSP4.10進(jìn)行FourGamete分析，進(jìn)行β-珠蛋白基因中重組事件以及發(fā)生位置的評估。用Alequin3.01軟件計(jì)算各個(gè)位點(diǎn)之間的兩兩相對連鎖不平

13、衡系數(shù)D’值、兩兩相對連鎖不平衡相關(guān)系數(shù)r2值、各個(gè)人群β-珠蛋白基因的核苷酸分離位點(diǎn)數(shù)θ值和任意兩序列之間核苷酸差異的平均數(shù)π值，并計(jì)算Tajima’sD值進(jìn)行分析對象的中性檢驗(yàn)，評估SNP之間的兩兩不平衡關(guān)系及與選擇作用的關(guān)系。用Net-Work4.1.1.2軟件構(gòu)建樣品的單倍型系統(tǒng)樹，觀察各種單倍型之間的演變關(guān)系。參考相關(guān)史料來解釋和討論基因突變及其人群起源和進(jìn)化歷史。 結(jié)果與討論： 在海南島黎族人群隨機(jī)大樣品調(diào)查

14、得出的θ地貧CD41-42(-CTTT)突變攜帶率為8.16％，未發(fā)現(xiàn)其它突變，隨機(jī)抽取的201例黎族人CD41-42(-CTTT)突變的攜帶率為10.45％，抽樣樣本和人群的CD41-42(-CTTT)突變攜帶率結(jié)果之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。根據(jù)血液學(xué)參數(shù)和HbA2含量，在1624份廣西壯族隨機(jī)大樣品中調(diào)查得出θ地貧突變攜帶率為6.64％。在隨機(jī)抽取的354份壯族樣品和262例漢族樣品中，CD41-42(-CTTT)突變攜帶

15、率的結(jié)果分別為3.39％和3.05％，在剔除其它β-地貧突變后，最終入選的280例壯族樣品和226例漢族樣品中CD41-42(-CTTT)突變攜帶率的結(jié)果分別為3.92％和3.54％，兩組壯族樣本或兩組漢族樣本之間CD41-42(-CTTT)突變攜帶率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1.根據(jù)人群單倍型的特點(diǎn)、LD類型、FourGamete結(jié)果以及重組和突變或缺失發(fā)生的機(jī)率，結(jié)合黎族人群與壯族人群的起源和分化的時(shí)

16、間以及黎族遷徙史，我們推測中國人群的CD41-42(-CTTT)突變可能是單一起源，發(fā)生在黎族和壯族人群分化之前，至少已有3000的歷史，CD41-42(-CTTT)缺失突變單倍型HP20可能是最早出現(xiàn)的單倍型，然后在人群傳播過程中，通過基因轉(zhuǎn)換的方式產(chǎn)生HP47。 2.連鎖不平衡和遺傳多樣性分析結(jié)果表明海南漢族、海南黎族、廣西漢族和廣西壯族人群的β-珠蛋白基因在進(jìn)化過程中受到平衡選擇的作用，可能與瘧疾選擇作用相關(guān)。瘧疾選擇作用

17、可能是造成我國南方地區(qū)人群β-地貧攜帶率高于北方人群的重要原因之一。 3.建立者效應(yīng)可能是黎族人群CD41-42(-CTTT)突變攜帶率增高的重要原因。遺傳漂變可能是導(dǎo)致海南漢族、廣西漢族和廣西壯族人群CD41-42(-CTTT)突變攜帶率低于黎族人群的原因之一。 4.人群遷徙也是影響海南漢族、廣西漢族和廣西壯族人群CD41-42(-CTTT)突變分布的因素之一。廣西漢族人群和廣西壯族人群之間的CD41-42(-CTTT