nm23-H1基因調(diào)控人肺癌FAK信號通路及其分子機(jī)理的實驗研究.pdf

1、背景與目的肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。肺癌也是發(fā)病率和死亡率非常接近的惡性腫瘤，其總的治愈率僅為10％-15％，90％以上的肺癌死亡是由于肺癌轉(zhuǎn)移造成的。肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌的惡性標(biāo)志和特征，也是導(dǎo)致患者治療失敗和死亡的主要原因。因此，研究和闡明肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理，尋找逆轉(zhuǎn)或/和抑制肺癌轉(zhuǎn)移的分子靶點，開發(fā)治療肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子靶向藥物是未來肺癌研究領(lǐng)域的研究方向和重點課題，也是人類最終戰(zhàn)勝肺癌

2、的希望所在。周清華教授長期以來在該領(lǐng)域進(jìn)行了較深入和系統(tǒng)的研究，首先提出了“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級聯(lián)”的假說，建立了nm23-H1基因缺失的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981、空載體轉(zhuǎn)染人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981-pLXSN和轉(zhuǎn)染nm23-H1基因的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981-nm23-H1；證實了nm23-H1基因是“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級聯(lián)”的上游基因和關(guān)鍵基因；通過體外及體內(nèi)實驗均證明了轉(zhuǎn)染nm23-H1基因可以逆轉(zhuǎn)人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞

3、肺癌細(xì)胞株L9981的惡性表型和轉(zhuǎn)移表型；nm23-H1基因通過調(diào)控RAS通路、PKC通路、PKA通路，WNT通路發(fā)揮腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用；本實驗研究的目的是在上述研究工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討nm23-H1基因調(diào)控下游信號分子FAK和通過FAK信號傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)揮其抑止腫瘤轉(zhuǎn)移作用的分子機(jī)制。 材料與方法本研究應(yīng)用Westernblot檢測人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981和人低轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NL9980細(xì)胞FAK總蛋白和Tyr3

4、97FAK表達(dá)水平及差異；檢測人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981，空載體轉(zhuǎn)染人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981-pLXSN和轉(zhuǎn)基因人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981-nm23-H1細(xì)胞FAK總蛋白和Tyr397FAK表達(dá)水平及差異；應(yīng)用Boyden小室和細(xì)胞遷移運動劃痕實驗檢測L9981、L9981-pLXSN和L9981-nm23-H1肺癌細(xì)胞株體外侵襲運動能力及差異；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測L9981、L9981-pLXSN和L9981-

5、nm23-H1肺癌細(xì)胞株細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白表達(dá)水平及差異。探討了nm23-H1基因調(diào)控FAK信號通路及其分子機(jī)理，為闡明肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理，研究和開發(fā)針對肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子靶向治療藥物提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。 結(jié)果本研究在國內(nèi)外首次觀察到： 1、人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981和低轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NL9980間FAK總蛋白表達(dá)水平比較無顯著性差異(P＞0.05)。 2、人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L99813

6、97位磷酸化FAK蛋白表達(dá)水平顯著高于低轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NL9980(P＜0.01)。 3、人原代高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981、轉(zhuǎn)染空載體的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981-pLXSN和轉(zhuǎn)染nm23-H1基因的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981-nm23-H1間FAK總蛋白表達(dá)水平比較無明顯差異(P＞0.05)。 4、轉(zhuǎn)染nm23-H1基因的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981-nm23-H1397位磷酸化FAK

7、蛋白表達(dá)水平顯著低于人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981和轉(zhuǎn)染空載體的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌株L9981-pLXSN(P＜0.01)，而L9981與L9981-pLXSN肺癌細(xì)胞株間Tyr397FAK表達(dá)水平比較無顯著性差異(P＞0.05)。 5、在轉(zhuǎn)染空載體的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌株L9981-pLXSN和轉(zhuǎn)染nm23-H1基因的人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981-nm23-H1中出現(xiàn)了一條約130KD的蛋白條帶。 6.nm23

8、-H1基因轉(zhuǎn)染可使L9981細(xì)胞株細(xì)胞偽足減少，折光性降低，并降低細(xì)胞粘附能力。 7.nm23-H1基因轉(zhuǎn)染可明顯降低L9981肺癌細(xì)胞株的體外侵襲能力及運動遷移能力。 8.nm23-H1基因轉(zhuǎn)染可明顯減少人肺癌細(xì)胞株L9981微絲的聚集，增加微管蛋白的聚合。 9.nm23-H1基因轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞株L9981后，可顯著下調(diào)整合素αv，α-actin基因的表達(dá)水平。 結(jié)論(1)人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L99