SOCS3基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和遷移作用的研究.pdf

1、世界范圍內(nèi)，子宮內(nèi)膜癌是僅次于宮頸癌的女性生殖道惡性腫瘤，且其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。目前在西方這一腫瘤已成為女性生殖道腫瘤中最為常見的病種，占新發(fā)現(xiàn)婦科腫瘤的一半。一般而言，患者年齡在60至70歲之間，而一般女性一生中罹患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)在2.5％左右。90％子宮內(nèi)膜癌患者的臨床癥狀表現(xiàn)為絕經(jīng)后陰道流血，不過絕經(jīng)后的陰道流血患者中僅有10％最后確診為子宮內(nèi)膜癌，部分患者還可出現(xiàn)陰道流液，此類患者早期可僅表現(xiàn)為少量血性白帶，隨著疾病進(jìn)展而發(fā)生

2、嚴(yán)重感染時(shí)可出現(xiàn)膿血樣液體排出。絕經(jīng)前女性的首發(fā)癥狀則往往為月經(jīng)周期混亂，并有部分患者在宮頸涂片檢查中偶然發(fā)現(xiàn)異常子宮內(nèi)膜細(xì)胞。根據(jù)FIGO(2009)分期，子宮內(nèi)膜癌可分為4期:Ⅰ期指腫瘤局限于子宮體部，并進(jìn)一步分為Ⅰa期及Ⅰb期，其中Ⅰa期腫瘤浸潤深度小于子宮肌層二分之一，而Ⅰb期腫瘤浸潤深度則已超過或等于子宮肌層的二分之一;Ⅱ期指腫瘤已侵犯宮頸間質(zhì)，但尚無宮體外蔓延;Ⅲ期指腫瘤已有局部和（或）區(qū)域擴(kuò)散，其中Ⅲa期指腫瘤已侵犯子宮漿

3、膜層和（或）附件，Ⅲb期指腫瘤已侵犯陰道和（或）宮旁組織，Ⅲc期指盆腔淋巴結(jié)和（或）腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Ⅲc1期指盆腔淋巴結(jié)陽性，Ⅲc2期指腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)陽性伴（或不伴）盆腔淋巴結(jié)陽性;V期指腫瘤侵犯膀胱和（或）直腸粘膜，和（或）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，Ⅳa期指腫瘤侵犯膀胱和（或）直腸粘膜，Ⅳb期腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，包括腹腔內(nèi)和（或）腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。80～90％屬于內(nèi)膜樣癌，按腺癌分化程度分為Ⅰ級(jí)(高分化G1)，Ⅱ級(jí)（中分化G2），Ⅲ級(jí)（低分化G3）

4、三級(jí)。對(duì)于子宮內(nèi)膜癌而言，其預(yù)后整體而言相對(duì)較好，且多數(shù)患者在就診時(shí)多處于疾病早期。影響預(yù)后的因素主要有:1、腫瘤的惡性程度及病變范圍，包括手術(shù)病理分期、組織學(xué)類型、腫瘤分級(jí)、肌層浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移及子宮外轉(zhuǎn)移等;2、患者全身狀況;3、治療方案的選擇。多數(shù)子宮內(nèi)膜癌的復(fù)發(fā)在手術(shù)治療后的2-3年內(nèi)出現(xiàn)。對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的首選治療方式為手術(shù)，手術(shù)目的是進(jìn)行手術(shù)病理分期，確定病變范圍及手術(shù)預(yù)后相關(guān)因素，切除病變子宮及其他可能存在轉(zhuǎn)移的病灶，首先

5、留取腹腔積液或盆腔沖洗液進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查，然后腹腔探查。如考慮存在子宮外部侵犯的患者，還需進(jìn)行擴(kuò)大的筋膜外子宮切除術(shù)及雙側(cè)輸卵管卵巢切除。同時(shí)，許多患者在術(shù)后為避免陰道穹窿的復(fù)發(fā)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等原因仍需接受輔助治療。在手術(shù)術(shù)式選擇中，目前已有充足證據(jù)支持使用腹腔鏡進(jìn)行子宮切除術(shù)或者是腹腔鏡輔助下的經(jīng)陰道子宮切除術(shù)。放療也是常用的治療方式，這一治療既可用于術(shù)后的輔助治療，也可單獨(dú)作為不適宜接受手術(shù)患者的根治性治療，并且可應(yīng)用于術(shù)后復(fù)發(fā)患者的局

6、部治療。目前盡管術(shù)后輔助性放療可以改善局部復(fù)發(fā)控制情況，但對(duì)于患者的整體生存仍無明顯改善。與之相比，對(duì)于高危患者的早期化療目前尚無統(tǒng)一定論。
　　目前認(rèn)為子宮內(nèi)膜癌有兩種發(fā)病類型:雌激素依賴型（Ⅰ型）與（Ⅱ型）非雌激素依賴型，子宮內(nèi)膜癌絕大多數(shù)(80％)屬于Ⅰ型，該型往往繼發(fā)于子宮內(nèi)膜不典型增生。肥胖、不孕、胰島素抵抗以及長期無孕激素拮抗的應(yīng)用雌激素治療等因素均與Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌發(fā)病相關(guān)。而Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌則包括子宮內(nèi)膜漿液性癌、透明

7、細(xì)胞癌、腺鱗癌、粘液腺癌等類型，與雌激素作用無關(guān)，癌灶容易擴(kuò)散，預(yù)后較差。兩者在分子機(jī)制層面也各具特點(diǎn)。Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌通常具有PTEN抑癌基因、K-ras、Beta-catenin等基因的突變及錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷有關(guān)。而Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌多與p53抑癌基因的突變相關(guān)?？梢娮訉m內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，而具體發(fā)病的機(jī)理卻尚未明確闡明?？梢娔壳白訉m內(nèi)膜癌的治療仍充滿挑戰(zhàn)，而對(duì)其致病分子機(jī)制的研究則可能使我們獲得更為有效、特異的治療方式。這其中針對(duì)調(diào)節(jié)腫

8、瘤細(xì)胞增殖及遷移等與預(yù)后密切相關(guān)的分子信號(hào)通路的研究一直是子宮內(nèi)膜癌研究領(lǐng)域的中心問題。
　　細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化等方面發(fā)揮重要作用，該家族在惡性腫瘤疾病中的作用已日益引起人們的關(guān)注。SOCS家族是1997年以來相繼被發(fā)現(xiàn)的JAK/STAT信號(hào)通路的主要負(fù)性調(diào)控因子家族，由SOCS1～SOCS7和CIS共8種成員組成，其結(jié)構(gòu)

9、相似，由N區(qū)、中央?yún)^(qū)SH2結(jié)構(gòu)域和C端SOCS盒組成。目前對(duì)SOCS3的研究較為清楚，其廣泛表達(dá)于不同類型組織和細(xì)胞中。SOCS3基因(NM_003955.3)位于17q25.3，CDS區(qū)由675個(gè)連續(xù)的核苷酸組成，編碼225個(gè)氨基酸，編碼框的上游約1.1kb范圍內(nèi)是該基因的啟動(dòng)子區(qū)，其在人、大鼠、小鼠之間具有高度保守性，均由兩個(gè)STAT結(jié)合域、一個(gè)TAT框和一個(gè)GC富集區(qū)組成。SOCS-3基因的啟動(dòng)子含有STAT1/STAT3和STA

10、T5b的結(jié)合位點(diǎn)。這類因子主要與JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路相互作用。SOCS-3是SOCS家族中研究最多的成員之一，已有研究提示多種腫瘤組織中 SOCS3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島存在高度甲基化，而基因啟動(dòng)子區(qū)失活是導(dǎo)致抑癌基因失活的主要機(jī)制，SOCS3基因可能作為一個(gè)抑癌基因發(fā)揮作用。He首次于2003年發(fā)現(xiàn)了在人肺癌中SOCS3啟動(dòng)子超甲基化導(dǎo)致其基因沉默，SOCS3蛋白表達(dá)缺失。Weber等報(bào)道的94例頭頸鱗狀細(xì)胞癌中僅有10例發(fā)現(xiàn)S

11、OCS-3蛋白表達(dá)為陽性，且其中9例組織中SOCS-3啟動(dòng)子CpG島呈超甲基化狀態(tài)。而將SOCS-3導(dǎo)入CAL-27細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的SOCS-3能明顯抑制癌細(xì)胞生長。Cui等發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)入SOCS-3可以抑制STAT3的磷酸化，并介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。目前認(rèn)為SOCS基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的異常高度甲基化是導(dǎo)致基因沉默的主要機(jī)制。而已知的SOCS3與JAK/STAT通路相互作用途徑主要有3種:①抑制JAK激酶活性阻斷JAK/ST

12、AT通路;②與細(xì)胞因子受體結(jié)合，拮抗STAT對(duì)活化受體的激活;③通過SOCS盒促進(jìn)所結(jié)合蛋白發(fā)生蛋白酶體依賴途徑的降解。SOCS-3通過上述機(jī)制抑制STAT3磷酸化，負(fù)反饋抑制JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制了腫瘤的生長。而在與激素分泌相關(guān)的腫瘤中，SOCS-3則對(duì)腫瘤增殖起到促進(jìn)作用。但近期對(duì)于卵巢癌的研究也提示腫瘤細(xì)胞中存在SOCS3，并可進(jìn)一步激活STAT-3磷酸化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活。而對(duì)于子宮內(nèi)膜癌而言，目前尚不確定SO

13、CS家族在其發(fā)展中所起的作用。
　　目的:探索子宮內(nèi)膜癌中SOCS-3的表達(dá)情況，以及其對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞系增殖遷移能力的影響，評(píng)估SOCS3作為潛在治療靶點(diǎn)的可能性，探討其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制。從而為子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，為子宮內(nèi)膜癌的臨床預(yù)防及治療提供新的思路。
　　方法:采用免疫組化染色法檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜癌組織中的SOCS3表達(dá)情況，分析兩者間的表達(dá)差異，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

14、構(gòu)建SOCS3載體質(zhì)粒，以慢病毒包裝并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞擴(kuò)增病毒，收取病毒液后對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染以構(gòu)建SOCS3穩(wěn)定表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞系，以空載體HEC-1B細(xì)胞系作為對(duì)照。對(duì)兩組HEC-1B細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，QPCR鑒定SOCS3穩(wěn)定細(xì)胞系SOCS3表達(dá)情況。之后分別提取蛋白，BCA法行蛋白定量，SDS電泳轉(zhuǎn)膜后行免疫反應(yīng)，并利用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯影、定影以觀察兩種細(xì)胞中SOCS3的表達(dá)情況。之后應(yīng)用EdU標(biāo)記法及MT

15、T實(shí)驗(yàn)比較SOCS3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞與空載體對(duì)照細(xì)胞增殖水平，以流式細(xì)胞計(jì)數(shù)比較兩者細(xì)胞周期情況，并以Transwell法檢測(cè)兩種細(xì)胞遷移能力的差別。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果提示SOCS3在腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織，正常子宮內(nèi)膜組織與子宮內(nèi)膜癌組織中強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為90％(18/20)和31.9％(43/135)，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=16.860，P＜0.001)。利用慢病毒包裝的SOCS3載體與空載體

16、分別成功轉(zhuǎn)染了兩組HEC-1B細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng)，熒光染色、QPCR及Western Blot鑒定結(jié)果提示SOCS3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系成功建立。EdU標(biāo)記法測(cè)定提示，與空載體對(duì)照組相比，SOCS3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系EdU標(biāo)記減少，提示其DNA合成活動(dòng)減弱，細(xì)胞增殖速度低。而MTT實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步支持了這一結(jié)論。通過對(duì)兩組細(xì)胞在第1至7天吸光度比較，兩者自第5天開始細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)明顯差別，SOCS3穩(wěn)定表達(dá)HEC-1B細(xì)胞系細(xì)胞數(shù)量低于空載體對(duì)照組

17、。其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)提示SOCS3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞多停滯于G0/G1期，S期及G2期細(xì)胞數(shù)量降低。Transwell實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步提示SOCS3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移能力降低。
　　結(jié)論:SOCS3在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達(dá)，而在SOCS3穩(wěn)定表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中，相比于空載體對(duì)照細(xì)胞，其增殖能力與遷移能力均有所下降。這一結(jié)果提示SOCS3可能在子宮內(nèi)膜癌中起到抑制癌癥發(fā)生發(fā)展的作用，而子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病可能與