基因芯片快速診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌感染.pdf

1、研究背景： 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病。近年來，由于臨床診斷策略的改進(jìn)、疫苗接種及大量廣譜抗生素的應(yīng)用，細(xì)菌性感染的病死率明顯下降。然而，隨著社會經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，人員流動(dòng)性明顯增大，加之嚴(yán)重的環(huán)境污染、交通事故致腦外傷發(fā)生率增高等，中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌感染率呈上升趨勢。細(xì)菌性腦膜炎仍位居世界感染性疾病病死率的前十位，且因病原菌診斷困難、治療延誤及濫用抗生素等，約25％～50％的細(xì)菌性腦膜炎存活者仍遺留肢體活動(dòng)障礙、失語、癲

2、癇、智力障礙等后遺癥。本病最常見的病原菌為腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌B型，病死率分別為10.3％、26.3％及6.0％。近年來結(jié)核性腦膜炎亦呈死灰復(fù)燃之勢?？焖?、準(zhǔn)確地診斷病原菌，早期合理應(yīng)用抗菌藥物迅速控制病情，是降低死亡率、防止并發(fā)癥的最有效措施。臨床病原菌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”為細(xì)菌培養(yǎng)，但由于某些細(xì)菌生長困難、培養(yǎng)要求條件太高、培養(yǎng)前已經(jīng)應(yīng)用抗生素等原因，細(xì)菌培養(yǎng)的陽性率極低，國外報(bào)道只有3.1％～8.3％，且培養(yǎng)周期長，

3、一般需24～48h，而結(jié)核分枝桿菌則需2～6周。因此，目前臨床工作中，大多依據(jù)臨床表現(xiàn)、腦脊液的細(xì)胞學(xué)、生化、免疫學(xué)檢查及血常規(guī)等綜合指標(biāo)，推測細(xì)菌或其它致病源感染的可能性。由于病原菌診斷方面的限制，從某種程度上，濫用抗生素已經(jīng)成為臨床工作者的無奈之舉，不但誤診及漏診的發(fā)生率增高，而且造成醫(yī)療資源的極大浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用16SrDNA這一保守系列，根據(jù)其高度恒定序列設(shè)計(jì)一對共有引物，選擇中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的11種常見病原菌包括腦膜炎萘瑟(氏

4、)菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希桿菌、綠銅假單胞菌、流感嗜血桿菌B型、表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、甲型溶血性鏈球菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌及結(jié)核分枝桿菌，通過優(yōu)化PCR條件，應(yīng)用不對稱PCR，分別對以上標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)，依據(jù)16SrDNA的可變序列，設(shè)計(jì)3組探針，第1組為針對所有細(xì)菌的共有探針，第2組針對革蘭陽性、革蘭陰性細(xì)菌，用于對革蘭陽性及革蘭陰性菌進(jìn)行篩選檢測，第3組分別針對腦膜炎萘瑟(氏)菌、大腸埃希桿菌、流感嗜血桿菌、無乳鏈球菌

5、、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌及結(jié)核分枝桿菌，將這10種探針集成到基因芯片上，與共有引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行反向雜交，通過基因芯片掃描儀對雜交結(jié)果進(jìn)行分析，從而在基因水平對致病細(xì)菌作出快速診斷。本實(shí)驗(yàn)共分三部分 一、多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA 二、基因芯片快速檢測常見致病菌 三、基因芯片技術(shù)在細(xì)菌性腦膜炎常見病原菌診斷中的應(yīng)用 第一部分：多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA 研究目的：

6、 1．建立一種PCR擴(kuò)增細(xì)菌染色體16SrDNA的優(yōu)化技術(shù)體系。 2．檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的特異性及敏感性。 3．探討不對稱PCR對16SrDNA擴(kuò)增的影響，為后續(xù)進(jìn)行的基因芯片雜交打下基礎(chǔ)。 結(jié)論 1 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的16SrDNA PCR技術(shù)體系，對11種常見細(xì)菌性腦膜炎致病菌擴(kuò)增后，均出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶，而對單純皰疹病毒，擴(kuò)增結(jié)果為陰性。證實(shí)本 方法具有較高的特異性。 2 倍比

7、稀釋顯示本擴(kuò)增體系檢測出的最低細(xì)菌菌落總數(shù)(colony forming unit，CFU)為37CFU/ml，提示本檢測技術(shù)具有較高的敏感性。 3 本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用引物濃度不對稱性PCR，對腦膜炎致病菌進(jìn)行擴(kuò)增，引物濃度為1∶5的不對稱性PCR仍具較好的擴(kuò)增效果。 第二部分：基因芯片快速檢測常見致病菌 研究目的： 1．建立一種生物素標(biāo)記的基因芯片檢測常見神經(jīng)系統(tǒng)感染致病菌的技術(shù)方法。 2．檢

8、測基因芯片對中樞神經(jīng)系統(tǒng)致病菌的特異性及敏感性。 3．探討提高基因芯片雜交效率的方法，為臨床應(yīng)用該技術(shù)診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌性感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 結(jié)論 1 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用生物素標(biāo)記的7種標(biāo)準(zhǔn)菌不對稱PCR產(chǎn)物，進(jìn)行芯片雜交，6種細(xì)菌均在相應(yīng)的共有探針、革蘭氏陽性或革蘭氏陰性及各自的探針區(qū)，檢測出特異的雜交信號。提示該體系具有較優(yōu)化的雜交條件。 2 細(xì)菌PCR混和產(chǎn)物雜交結(jié)果，證實(shí)該雜交體系具有較強(qiáng)的特

9、異性。 3 本雜交體系能夠檢測出的細(xì)菌最低稀釋度為10<'-7>，提示芯片雜交較PCR具有更強(qiáng)的敏感性。 4 生物素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)菌樣本，雜交后肉眼即可觀察結(jié)果，經(jīng)芯片識讀儀掃描后，雜交信號清晰、靈敏，且操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，該標(biāo)記方法具有 較好的臨床應(yīng)用前景 5 實(shí)驗(yàn)從雜交、顯色，至最終讀片、得出雜交結(jié)論，僅需2小時(shí)，操作較簡單，雜交信號直觀，具有較高的臨床實(shí)用價(jià)值。 第三部分 基因芯片技術(shù)在細(xì)菌性腦膜炎

10、常見病原菌診斷中的應(yīng)用 研究目的： 檢測基因芯片對臨床腦脊液樣本中致病菌診斷的特異性及敏感性。為該技術(shù)在臨床的廣泛應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 結(jié)論 1．16SrDNA擴(kuò)增對腦脊液細(xì)菌檢測的敏感性，顯著高于細(xì)菌培養(yǎng)。 2．基因芯片雜交結(jié)果與細(xì)菌培養(yǎng)診斷符合率為100％；提示該技術(shù)具有較高的 特異性。 3．本實(shí)驗(yàn)建立的雜交體系，能在4小時(shí)內(nèi)對常見腦膜炎細(xì)菌作出病原學(xué)診斷，操作簡單、經(jīng)濟(jì)，具有較