涎腺轉(zhuǎn)染CCL25提高唾液slgAi水平的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 口腔中的常見病、多發(fā)病如齲病、牙周病，是導(dǎo)致牙齒缺損、缺失的最主要原因，給人類的身心健康帶來巨大的危害。齲病、牙周病的發(fā)生均與細(xì)菌感染有關(guān)，不論是致齲菌還是牙周致病菌，都必須先定植于牙齒或牙周組織表面，才能發(fā)揮其致病作用，所以，防止病原菌對組織的黏附、定植，是預(yù)防口腔感染性疾病的有效途徑。
　　 分泌型免疫球蛋白A（secretoryimmunoglobulinA，sIgA）主要存在于外分泌液中，對粘膜組織

2、起免疫保護(hù)作用。口腔唾液中的sIgA可使病原微生物之間發(fā)生凝集現(xiàn)象，喪失活動(dòng)能力，或者與病原微生物結(jié)合，阻斷微生物表面的特異性結(jié)合點(diǎn)，從而干預(yù)微生物對口腔表面的附著，使之不再能附著到口腔表面，或至少使其附著量減少，所以說唾液中sIgA能阻止細(xì)菌在口腔組織的定植，是口腔抗感染的一道重要的天然免疫屏障。因此提高唾液中sIgA水平能減少細(xì)菌對口腔表面的附著，同時(shí)也可以對特異性抗原產(chǎn)生免疫作用，從而有效地預(yù)防口腔感染。
　　 粘膜相關(guān)趨

3、化因子CC家族的CCL25能定向引導(dǎo)記憶/效應(yīng)T細(xì)胞和部分IgA抗體分泌細(xì)胞(IgA+ASC)的遷徙歸巢，近年來的研究表明CCL25及其受體CCR9在人體小腸粘膜中表達(dá)最多，小腸中90％以上的T淋巴細(xì)胞都表達(dá)CCR9。除了誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞的歸巢也與CCL25/CCR9有關(guān)，在小鼠和人的小腸粘膜中IgA+ASCs上均有CCR9表達(dá)。
　　 CCL25/CCR9在小腸中的表達(dá)和作用已得到肯定，但到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)唾液腺中

4、有CCL25的表達(dá)。唾液腺是共同粘膜免疫系統(tǒng)的重要器官，唾液中的sIgA是由唾液腺中的漿細(xì)胞合成，所以本研究擬通過在唾液腺中轉(zhuǎn)染含CCL25基因片段的質(zhì)粒，介導(dǎo)更多的IgA+ASC歸巢到唾液腺，從而提高唾液中sIgA水平，為預(yù)防口腔組織感染提供一種新的方法和依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、從人小腸提取總RNA，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增CCL25基因片段并純化回收;引入SacⅠ、HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，與真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-3Ta

5、g-9連接，酶切電泳驗(yàn)證CCL25連接正確;轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli.DH5α，小提后作酶切、PCR及DNA序列測定。
　　 2、用Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為空白組(B)、轉(zhuǎn)染試劑對照組(M)、pCMV-3Tag-9/CCL25組(S)、pCMV-3Tag-9/GFP組(G)、pCMV-3Tag-9空載組(N)共5組。通過細(xì)胞培養(yǎng)、Real-timePCR和Westernblot檢測轉(zhuǎn)染

6、效果。
　　 3、Wistar大鼠頜下腺轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)分5組:A組為空白對照組，B組為導(dǎo)管逆行灌注質(zhì)粒pCMV-3Tag-9組，C組為腺體直接注射質(zhì)粒pCMV-3Tag-9組，D組為導(dǎo)管逆行灌注質(zhì)粒pCMV-3Tag-9/CCL25組，E組為腺體直接注射質(zhì)粒pCMV-3Tag-9/CCL25組;分別在1天、2天、3天、1周、2周和1個(gè)月六個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集唾液;3天時(shí)各組隨機(jī)取1只大鼠的頜下腺。免疫組化和ELISA檢測腺體轉(zhuǎn)染結(jié)果及唾

7、液中sIgA濃度。
　　 結(jié)果:
　　 1、重組質(zhì)粒pCMV-3Tag-9/CCL25酶切后電泳顯示在大約500bp和5000bp左右出現(xiàn)高亮度條帶，與目的片斷大小相符。經(jīng)DNA測序所得序列結(jié)果與CCL25cDNA序列一致。
　　 2、真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-3Tag-9/CCL25轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)良好，熒光強(qiáng)，24h、48h和72h轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的GFP均超過70％，轉(zhuǎn)染效率高。Real-timePCR

8、各組基因的擴(kuò)增曲線圖形好，均呈“S”形，表明擴(kuò)增正常。S組基因在24h和48h均明顯地表現(xiàn)出比對照樣品的基因表達(dá)水平高。Westernblot結(jié)果顯示僅S組在20KD左右有明顯條帶(融合表達(dá)蛋白約為20KD)，且72H比48H的表達(dá)量明顯高出很多。
　　 3、免疫組化的結(jié)果可見D組整個(gè)腺體內(nèi)均勻分布棕色顆粒，腺泡內(nèi)陽性染色強(qiáng)。E組腺體內(nèi)局部較密集的陽性染色。D組和E組唾液中sIgA水平明顯高于其他組，有顯著性差異(P＜0.01)