PDCD5基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染KM3細(xì)胞后的表達(dá).pdf

1、目的:構(gòu)建pYr-ads-4-PDCD5重組質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染于多發(fā)性骨髓瘤KM3細(xì)胞，并檢測(cè)PDCD5的表達(dá)，為后續(xù)進(jìn)行PDCD5基因促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究提供工具、奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:以pCMV-SPORT6-PDCD5為模板擴(kuò)增PDCD5基因編碼區(qū)（CDS區(qū)）。瓊脂糖凝膠電泳鑒定成功后，將其與pYr-adshuttle-4載體質(zhì)粒雙酶切連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)于含卡那霉素(K

2、an)培養(yǎng)基上，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙酶切鑒定，并將酶切正確的pYr-ads-4-PDCD5送去測(cè)序，把測(cè)序結(jié)果與欲得到的目的序列比對(duì)，從而判斷pYr-ads-4-PDCD5重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。pYr-ads-4-PDCD5構(gòu)建成功后，大量擴(kuò)增及大量抽提質(zhì)粒。設(shè)轉(zhuǎn)染目的基因組、轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組三組，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體介導(dǎo)pYr-ads-4-PDCD5轉(zhuǎn)染于多發(fā)性骨髓瘤KM3細(xì)胞株，48小時(shí)后在熒光顯微鏡

3、下觀察轉(zhuǎn)染效率，并予實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，qPCR)、蛋白免疫印跡術(shù)(Westernblot)分別檢測(cè)PDCD5在KM3細(xì)胞中的mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果:PCR擴(kuò)增PDCD5基因CDS，瓊脂糖凝膠電泳獲得大約400bp的目的基因，與PDCD5 CDS區(qū)大小相符，擴(kuò)增成功。與pYr-adshuttle-4載體質(zhì)粒酶切、連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)后，雙酶切鑒定切出

4、約400bp的PDCD5目的基因片段帶和約7000bp的載體片段帶。將酶切正確的pYr-ads-4-PDCD5基因測(cè)序結(jié)果與欲得到的目的序列比對(duì)，顯示擴(kuò)增出的PDCD5基因片段序列完全正確，證明pYr-ads-4-PDCD5重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染KM3細(xì)胞48小時(shí)后，目的基因組和空載體組熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率約為45％，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot測(cè)定PDCD5 mRNA