結(jié)核患者α-βTCR基因重排及CDR3譜型分析.pdf

1、研究背景和目的：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的慢性傳染病。MTB屬細(xì)胞內(nèi)感染菌，其免疫主要是以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫。T細(xì)胞通過(guò)TCR識(shí)別抗原，識(shí)別過(guò)程還受細(xì)胞表面的MHC分子限制。TCR分別由α/β或γ/δ兩條多肽鏈通過(guò)二硫鍵連接而成的膜結(jié)合型異二聚體。其中TCRα/β型大約占95％，在免疫中起主要作用。MTB感染后，T淋巴細(xì)胞通過(guò)其TCR特異的結(jié)合單核-巨噬

2、細(xì)胞遞呈的抗原，進(jìn)而介導(dǎo)一系列的免疫反應(yīng)。 由于TCR的α和β鏈分別由Vα-Jα-Cα及Vβ-Dβ-Jβ-Cβ基因片斷重排后編碼，可構(gòu)成具有不同特異性的TCR分子，由此決定T細(xì)胞識(shí)別抗原的多樣性和特異性，從而可對(duì)環(huán)境中千變?nèi)f化的抗原產(chǎn)生特異性應(yīng)答。目前已知TCRVα分為32個(gè)功能性基因家族，TCRVβ分為24個(gè)基因家族。TCR重排過(guò)程中，V-(D)-J的基因片段進(jìn)行重排和隨機(jī)插入核甘酸(N區(qū))形成一高度可變區(qū)，稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)3(

3、CDR3)。通過(guò)對(duì)CDR3序列的分析，可作為判別T細(xì)胞克隆性的指標(biāo)。 目前，有關(guān)不同疾病個(gè)體TCRVα、Vβ限制性取用及CDR3譜型的研究范圍廣泛涉及感染性疾病、自身免疫性疾病、血液病、腫瘤等領(lǐng)域。但是有關(guān)結(jié)核病人TCR克隆性增殖的研究報(bào)道較少。TCR譜型的研究方法主要有：定量PCR、PCRDNA印跡、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、PCR-序列分析和PCR-Genescαn(基因掃描)-序列分析等多種方法。近年來(lái)多采用TC

4、RVα32個(gè)家族、TCRVβ24個(gè)家族分別設(shè)計(jì)上游引物，針對(duì)TCR保守的C區(qū)或選取J區(qū)設(shè)計(jì)下游引物，分別配對(duì)擴(kuò)增TCR序列中包括CDR3區(qū)的部分區(qū)域。獲得PCR產(chǎn)物直接或克隆后測(cè)序，通過(guò)分析其TCR取用特點(diǎn)和CDR3譜型研究其與疾病的關(guān)系。此方法雖然較為靈敏和準(zhǔn)確，但是分別配對(duì)擴(kuò)增工作量相對(duì)較大。因此有必要建立一種相對(duì)較為簡(jiǎn)化的多重PCR擴(kuò)增方法。而且，以往的研究多集中于TCRβ鏈，但是，對(duì)于α/βT細(xì)胞TCR的功能性研究應(yīng)包括α和β鏈

5、。 我們的目的是建立TCRα和β鏈多重PCR擴(kuò)增方法，并擴(kuò)增出結(jié)核病人病變局部標(biāo)本中特異性淋巴細(xì)胞TCRα和β鏈全長(zhǎng)序列。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用DNAstαr軟件及網(wǎng)上TCR資源進(jìn)行分析比對(duì)，進(jìn)而研究結(jié)核病人在結(jié)核活動(dòng)期是否存在T細(xì)胞克隆性增殖，確定TCRVα、Vβ以及Jα、Jβ所屬家族，研究特異性克隆增殖T細(xì)胞TCR譜的取用格局，以及TCRα和TCRβ鏈各自的CDR3譜型，為進(jìn)一步研究MTB特異反應(yīng)性TC

6、R四聚體建立基礎(chǔ)。 研究?jī)?nèi)容和方法：分離活動(dòng)性肺結(jié)核病人肺泡灌洗液(BAL)和胸水(PLF)標(biāo)本中的淋巴細(xì)胞，胸水標(biāo)本分離的淋巴細(xì)胞進(jìn)一步分離CD4+、CD8+細(xì)胞，然后分別提取其總RNA。胸水標(biāo)本分離的部分淋巴細(xì)胞染色后進(jìn)行流式細(xì)胞分析。提取的RNA利用AltasSwitchMechanismAtthe5'-endofReverseTranscript(SMART)方法逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行LDPCR合成cDNA第二鏈。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)設(shè)計(jì)

7、能擴(kuò)增包括TCRα和TCRβ鏈先導(dǎo)序列起始密碼的各自特異上游擴(kuò)增引物，及根據(jù)TCRC區(qū)保守序列設(shè)計(jì)的下游引物(包括終止密碼)，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以分別獲得TCRα和TCRβ全長(zhǎng)編碼序列。獲得的PCR產(chǎn)物回收后用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切，與相應(yīng)的酶切處理的載體純化產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌JM109，挑取氨芐青霉素抗性單菌落經(jīng)培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒，然后用相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定。陽(yáng)性克隆委托公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAstar軟件

8、及網(wǎng)上TCR資源進(jìn)行分析、比對(duì)，確定擴(kuò)增序列TCRVα、TCRVβ所屬亞家族，研究T細(xì)胞的克隆增殖情況、TCR譜取用格局及各TCRα和TCRβ鏈的CDR3堿基和氨基酸序列。 結(jié)果：活動(dòng)性肺結(jié)核肺泡灌洗液標(biāo)本3例，磁珠分離純化結(jié)核胸水標(biāo)本CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞2例并分別擴(kuò)增出TCRα和TCRβ鏈PCR產(chǎn)物。α鏈長(zhǎng)800bp左右，β鏈長(zhǎng)900bp左右。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序共獲得65個(gè)α鏈全長(zhǎng)序列，38個(gè)β鏈全長(zhǎng)序列。

9、 序列結(jié)果分析：TCRα鏈以AV1S2、AV12S3、AV12S2、AV12S1為主，主要集中于AV1S2(50.8％)、AV12S3(46％)；TCRβ鏈以BV2、BV29S1、BV14、BV4S1、BV4S2為主，主要集中于BV2(36.8％)、BV29S1(52.6％)。 氨基酸序列分析顯示同一病例及不同病例之間CDR3區(qū)呈現(xiàn)多樣性，但是在BAL及PLF標(biāo)本中，各病例內(nèi)或病例之間也發(fā)現(xiàn)有個(gè)別相同或相似的氨基酸序列：BAL標(biāo)

10、本1、BAL標(biāo)本3與PLF標(biāo)本1、PLF標(biāo)本2的CD8+各有一條β鏈的CDR3區(qū)具有相同的氨基酸序列：SVGTGTLHQETQY；BAL標(biāo)本2和BAL標(biāo)本3的各有2條α鏈有相同的CDR3序列：AVRDWAGNMLT；PLF標(biāo)本2的CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞各有2條α鏈有相同的CDR3序列：AVRDQNYQLI。在某些不同的克隆也存在不同長(zhǎng)度的相同基序。在BAL標(biāo)本2的一個(gè)α鏈和一個(gè)β鏈的CDR3均有：AV…DNN…RLW序列；在PLF標(biāo)

11、本1的CD8+淋巴細(xì)胞的兩條α鏈CDR3均含有：AMSDGN…NMLT；在PLF標(biāo)本2的CD8+淋巴細(xì)胞的兩條α鏈CDR3均含有：AM…DDKII。 8例活動(dòng)性肺結(jié)核病人PLF標(biāo)本流式分析結(jié)果：CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞分別約占PLF總細(xì)胞的40％～60％和20％～30％。 結(jié)論：建立多重PCR方法擴(kuò)增活動(dòng)性結(jié)核患者病變局部標(biāo)本TCRα和β鏈全長(zhǎng)序列，既減少以往針對(duì)TCRVα、TCRVβ各亞家族分別進(jìn)行擴(kuò)增的工作量，又

12、能滿足臨床小量樣本的要求。 序列分析提示結(jié)核患者病變局部存在特異性T細(xì)胞的克隆性增殖，TCRα和β鏈譜型呈限制性取用。克隆增殖的TCRCDR3氨基酸序列呈多樣性特點(diǎn)，但是在同一患者及不同患者也存在個(gè)別相同的CDR3氨基酸序列，提示這些相同的CDR3氨基酸序列對(duì)于識(shí)別MTB多肽可能具有特異性。 流式細(xì)胞及TCR序列分析結(jié)果顯示，在結(jié)核患者病變局部存在結(jié)核特異性T淋巴細(xì)胞的集聚。集聚的T細(xì)胞以CD4+T細(xì)胞為主(40％～60