豬瘟C株疫苗免疫豬CD8+T細(xì)胞TCRα、β鏈CDR3譜系及分子特征初步分析.pdf

1、抗原特異性T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)克隆性研究已被廣泛應(yīng)用于人類疾病的診斷和治療，但在動物疫病特別是豬瘟上未見報道。本研究用豬瘟C株疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生針對豬瘟病毒的免疫應(yīng)答，通過分析刺激前后外周血CD8+T細(xì)胞TCR互補(bǔ)決定區(qū)3(complementaritydetermining region3，CDR3)譜型，從CD8+T細(xì)胞中篩選出豬瘟抗原特異的TCR基因家族，通過二次刺激進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。將篩選出的呈現(xiàn)

2、明顯單克隆或寡克隆性擴(kuò)增的TCR家族CDR3序列通過PCR法克隆到T載體上，挑取多個克隆測序，尋找出多個克隆CDR3區(qū)出現(xiàn)相同基因序列和保守基序的TCR基因。結(jié)果顯示:豬瘟C豬疫苗免疫后，外周血CD8+T細(xì)胞中存在單克隆和寡克隆增殖的TCR家族，并呈現(xiàn)規(guī)律性消長變化和保守的氨基酸模序，表明單克隆和寡克隆增殖的TCR家族與豬瘟病毒抗原肽的識別存在相關(guān)性，在一定程度上為豬瘟病毒T細(xì)胞表位的挖掘和新型疫苗的開發(fā)提供理論支持。本研究取得如下進(jìn)展

3、:
　　1.明確了初次免疫前后CD8+T細(xì)胞αβTCR的譜型變化特征。通過RT-PCR擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞19個TRAV家族和20個TRBV家族CDR3，利用基因掃描-譜型分析技術(shù)分析TCR CDR3譜型分布。譜型結(jié)果表明，免疫前幾乎所有TRAV/BV家族CDR3呈典型的高斯分布，絕大多數(shù)家族含有8條以上不同熒光強(qiáng)度、不同序列長度的峰。免疫后，一些TCR家族呈現(xiàn)克隆性增殖，并且其克隆性增殖維持一定時間后，在第15d又恢復(fù)到免疫前的高

4、斯分布。CDR3譜型的變化規(guī)律暗示這些克隆性增殖的TCRAV和BV家族與豬瘟病毒的感染存在相關(guān)性。
　　2.明確了二次免疫后血清抗體滴度變化特征。相較于初次免疫，二次免疫后血液中抗體濃度上升快，抗體效價高，抗體高峰持續(xù)時間長。表明初次免疫后機(jī)體對疫苗產(chǎn)生了有效的免疫記憶，再次接種后機(jī)體免疫系統(tǒng)迅速反應(yīng)，產(chǎn)生高效的免疫應(yīng)答，符合記憶性免疫的特征。
　　3.明確了二次免疫后CD8+T細(xì)胞αβTCR的譜型變化規(guī)律。同初次免疫類似，

5、二次免疫前大部分TRAV/BV家族CDR3呈典型的高斯分布;不同的是，二次免疫后，克隆性增殖家族出現(xiàn)的時間早于初次免疫，持續(xù)時間長，而且克隆性增殖的TCR家族其優(yōu)勢克隆峰RI值明顯強(qiáng)于初次免疫。同時我們發(fā)現(xiàn)， P1豬的AV8-3S、AV22，P2豬的AV4S，P4豬的DV1、BV15S在初次免疫和二次免疫后均呈現(xiàn)克隆性增殖。提示二次免疫后，豬瘟病毒相關(guān)的記憶性T細(xì)胞被活化并呈現(xiàn)克隆性增殖。
　　4.成功地對二次免疫后呈現(xiàn)克隆性擴(kuò)增

6、的的TRAV和TRBV家族CDR3序列結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析。PCR擴(kuò)增克隆性增殖TCR基因家族CDR3，并進(jìn)行測序和生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分克隆性增殖的家族其CDR3具有保守的氨基酸基序。對于克隆性增殖的TRAV家族，“KL”氨基酸基序在五個家族的四個均有出現(xiàn)，各家族內(nèi)也各自存在保守基序;對于克隆性增殖的TRBV家族，“QY”氨基酸基序在七個冢族的五個中均出現(xiàn)，“GG”在七個家族的六個中均出現(xiàn)。另外，AV22、AV4、BV27和B