電針增加Neurogenin2表達和促進神經發(fā)生從而改善全腦缺血后小鼠神經行為學的研究.pdf

1、背景
　　隨著醫(yī)療條件的進步,腦中風的存活率已經有了很大的提高,但是腦中風的后遺癥仍然是亟需攻克的難題。目前認為中風后神經系統(tǒng)障礙的主要原因,是沒有足夠的新生神經元來替代凋亡的神經細胞,并且發(fā)揮功能?，F(xiàn)在的研究揭示在成年哺乳動物中樞神經系統(tǒng)的側腦室外側壁室下帶(SVZ)和海馬齒狀回(DG)的顆粒下層儲存有神經干細胞,可以在一定的條件下增殖分化成神經元和膠質細胞,參與神經功能的修復過程,稱之為神經發(fā)生。
　　針灸在治療中風后遺

2、癥方面有顯著的療效和悠遠的歷史,電針(electroacupuncture,EA)是融合針灸理論和生物學電刺激的產物,能產生和針刺相同的效應,無痛且安全可靠,臨床上已經廣泛用于中風后的治療,但是具體機制仍有待發(fā)掘研究。
　　Neurogenin2(Neurog2)是調節(jié)胚胎期大腦皮質神經發(fā)生和神經元放射狀遷移的關鍵的轉錄因子。它在神經系統(tǒng)不同區(qū)域參與了神經元的分化與亞型的決定。Neurog2在成年哺乳動物腦缺血后的表達的研究報道很

3、少,亦不清楚。
　　本實驗構建了動物的全腦缺血再灌注(ischemiareperfusion,I/R)模型,觀察早期給予電針治療能否改善缺血后的運動和認知功能障礙,并探討了可能的機制,同時觀察了缺血后Neurog2表達動態(tài)變化,探索電針治療改善缺血后的運動和認知功能障礙是否與增加Neurog2和促進神經發(fā)生相關,并為電針治療中風以及利用Neurog2蛋白治療腦中風提供相關實驗證據。
　　實驗一電針能有效改善腦缺血后小鼠的運動

4、和認知功能
　　目的
　　探討電針在成年動物腦缺血后的治療的有效性。
　　方法
　　5月齡的C57雄性小鼠,體重超過20g,根據SPSS統(tǒng)計軟件產生隨機數(shù)字將其隨機化分成四組:假手術組(sham組n=6),假手術組+電針治療組(EA+sham組n=6),全腦缺血組(I/R組n=6),電針+全腦缺血組(EA+I/R組n=6),采用雙側頸總動脈結扎20min再恢復血液灌流的方法構建全腦缺血模型,給予EA治療的兩組則在

5、構建模型成功后連續(xù)5d,每天給予電針刺激百會穴,其參數(shù)基于本實驗室前期實驗成果:時長30min、頻率15/2Hz、強度1-2mA。電針治療結束后,進行神經行為學評分以及水迷宮測試。
　　結果
　　1)運動功能評分:與sham組相比,EA+sham組的神經行為學評分較優(yōu)于對照組,但沒有統(tǒng)計學差異,而缺血兩組相比,EA+I/R組的評分優(yōu)于I/R組,差異具有統(tǒng)計學差異。缺血兩組的運動功能明顯的較對照兩組的差。2)水迷宮測試:定向航

6、行試驗,與I/R組相比較,EA+I/R組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短,同時EA+sham組小鼠的逃避潛伏期較sham組為短,但沒有統(tǒng)計學差異。空間探索實驗結果顯示,在實驗的第6天,EA+I/R組小鼠與I/R組相比其在平臺所在象限游動的時間明顯較長(*P<0.05),EA+sham組小鼠的目標象限時間與sham組相比也較長。
　　結論
　　電針能夠有效的改善全腦缺血后小鼠的運動和認知功能,對于全腦缺血后的癥狀有較好的治療作用。

7、r>　　實驗二電針抑制全腦缺血后小鼠神經元凋亡和促進神經發(fā)生
　　目的
　　探討電針改善全腦缺血后小鼠的運動和認知功能是否與通過抑制神經元凋亡和促進神經發(fā)生有關。
　　方法
　　5月齡成年C57雄性小鼠,采用結扎雙側頸總動脈構建全腦缺血模型,隨機分成四組sham組(n=9),EA+sham組(n=9),I/R(n=9),EA+I/R組(n=9)。EA+sham組和EA+I/R組則在構建模型成功后第二天開始每天給予

8、電針刺激百會穴,其參數(shù):時長30min、頻率15/2Hz、強度1-2mA。于建模后第二天四組動物腹腔注射Brdu,連續(xù)14d,劑量50mg/kg。于注射Brdu結束后灌注切腦片進行神經元凋亡TUNEL檢測,尼氏染色和免疫熒光染色。
　　結果
　　1)神經發(fā)生的結果相較于sham組,缺血兩組的Brdu陽性細胞數(shù)目的表達增加,電針治療后神經發(fā)生的數(shù)目更加明顯,并且與Neurog2有共定位。2)TUNEL陽性細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)EA+I/

9、R組的TUNEL陽性細胞計數(shù)少于單純缺血組,說明電針具有抑制神經元凋亡的作用,而兩個sham組并未檢測到凋亡的神經元。3)尼氏染色結果提示,缺血兩組小鼠海馬內神經元排列紊亂,細胞內尼氏小體消失,但是給予電針處理的缺血組的神經元損害程度相對減輕。
　　結論:電針刺激改善了腦缺血小鼠的神經行為學發(fā)揮腦保護作用很可能是通過抑制神經元凋亡和促進神經發(fā)生這兩點實現(xiàn)的。
　　實驗三電針促進腦缺血后小鼠腦內Neurog2表達研究
　

10、　目的
　　探討腦缺血后成年小鼠腦內Neurog2的表達變化以及電針能否激活神經前體基因Neurog2的表達。
　　方法
　　5月齡的C57雄性小鼠,體重超過20g,根據SPSS統(tǒng)計軟件產生隨機數(shù)字將其隨機化分為四組,sham組(n=9),EA+sham組(n=9),I/R組(n=15),EA+I/R組(n=9),采用雙側頸總動脈結扎20min再恢復血液灌流的方法構建全腦缺血模型。I/R組分別在3d、5d、7d各時刻分

11、別處死三只實驗小鼠。EA+I/R組和EA+sham組則在構建模型成功后連續(xù)5d,每天給予電針刺激百會穴,其參數(shù)基于本實驗室前期實驗成果:時長30min、頻率15/2Hz、強度1-2mA。電針治療結束后,實行頸椎脫臼法處死小鼠。立刻置冰上取材,完整剝離小鼠雙側的海馬組織,提取RNA做PCR實驗分析,并灌注取腦進行免疫熒光檢測。
　　結果
　　1)Neurog2在成年小鼠全腦缺血再灌注損傷后的表達情況:從檢測到Neurog2的m

12、RNA水平看來,與假手術組相比,缺血后3dNeurog2的表達逐漸增加,5d時達到峰值(P<0.01),7d開始回落。2)電針治療后Neurog2的表達變化:當給予Sham組加電針治療后,相比單純Sham組Neurog2的水平明顯增加(P<0.01),缺血加電針治療組的mRNA水平也明顯較缺血組增加(P<0.001),而兩個電針組相比較則缺血加電針組Neurog2的表達也是高于單純電針組。3)免疫熒光染色可以看到腦缺血后Neurog2表

13、達增加,并且在電針刺激后表達明顯增強。
　　結論:Neurog2在成年動物腦缺血再灌注后的表達會被激活呈現(xiàn)一個動態(tài)的變化,并且電針可以促進Neurog2的表達增加。
　　實驗四Neurog2腦內注射改善神經行為學以及促進神經發(fā)生的研究
　　目的
　　研究側腦室注射Neurog2蛋白對腦缺血小鼠神經功能及海馬區(qū)神經發(fā)生的影響,探討側腦室注射Neurog2蛋白的作用。
　　方法
　　將18只C57小鼠隨機

14、分為3組:假手術組(sham組)和全腦缺血模型組(I/R組),缺血組加注射Neurog2蛋白組(Neurog2+I/R組),每組6只。第三組于建立模型前1天,單次給予側腦室注射Neurog2蛋白(10umol/L)4ul。注射完畢后第二天構建全腦缺血模型,假手術組給予類似操作但不結扎頸總動脈,建模后每組小鼠每天連續(xù)注射腹腔注射Brdu7天,觀察給予注射Neurog2后各組小鼠的神經行為學和海馬的神經發(fā)生的情況。
　　結果