雞精原干細(xì)胞冷凍保存及其轉(zhuǎn)基因的探索.pdf

1、精原干細(xì)胞(SSCs)是雄性生殖細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有終生擴(kuò)增性和永生性，是產(chǎn)生雄性生殖細(xì)胞的保證，也是生殖系中唯一的在成體中還能增殖的細(xì)胞。目前，SSCs已成為發(fā)育學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，并在獸醫(yī)臨床學(xué)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究分離提取了孵化至第19d的雞胚睪丸中SSCs進(jìn)行冷凍保存和體外培養(yǎng)，以期篩選出適合雞胚SSCs冷凍保存的適宜的冷凍保護(hù)劑及其濃度；同時(shí)進(jìn)行了體內(nèi)雞SSCs轉(zhuǎn)染外源基因(pEGFP-N1)的探索，觀

2、察了轉(zhuǎn)染后外源基因在精子、種蛋胚盤及不同孵化日齡胚胎及其組織器官中的表達(dá)，為以后利用SSCs生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞的研究奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果可歸納為以下幾個(gè)方面： 1.本研究采用二酶三步法獲取孵化第19d的雞胚SSCs，分別單獨(dú)采用濃度為5％、10％、15％的二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)、甘油作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行超低溫冷凍保存，復(fù)蘇后臺(tái)盼蘭染色檢查細(xì)胞存活率，比較不同濃度的各種冷凍保護(hù)劑對(duì)雞胚SSCs的冷凍保存效果；并在添加細(xì)胞因子

3、的體外培養(yǎng)體系中，觀察復(fù)蘇后SSCs存活和增殖。結(jié)果顯示：(1)當(dāng)DMSO的濃度為5％、10％及15％時(shí)，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率分別為73.1％、88.6％和74.8％，三者差異顯著；當(dāng)乙二醇濃度為5％、10％和15％時(shí)，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率分別為69.4％、83.1％和65.2％，三者差異顯著；當(dāng)甘油濃度為5％、10％、15％時(shí)，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率均小于15％，三者差異不顯著。(2)以10％DMSO為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保存的SSCs，復(fù)蘇后接種在

4、以雞胚胎成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇后生長(zhǎng)良好并聚集成集落，AKP染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，在無(wú)飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中沒有集落生成；而以5％和15％的DMSO為冷凍保護(hù)劑的SSCs，無(wú)論飼養(yǎng)層存在與否均無(wú)集落生成；以5％、10％、15％乙二醇為冷凍保護(hù)劑時(shí)，復(fù)蘇后無(wú)論飼養(yǎng)層存在與否，SSCs均能增殖，但未有AKP陽(yáng)性集落生成；以5％、10％、15％的甘油為冷凍保護(hù)劑時(shí)，復(fù)蘇后的SSCs存活時(shí)間極短，只能存活12h左右。比較不同

5、冷凍保護(hù)劑對(duì)SSCs的冷凍效果，結(jié)果顯示：10％DMSO對(duì)雞胚SSCs的冷凍保存效果最佳，復(fù)蘇后細(xì)胞的存活率及增殖能力顯著高于乙二醇和甘油在不同濃度下的保存效果。 2.以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(pEGFP-N1)為目的基因，直接將pEGFP-N1通過(guò)隨機(jī)打點(diǎn)法注射入睪丸，轉(zhuǎn)染SSCs，產(chǎn)生攜帶有pEGFP-N1的成熟精子用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞。比較了注射不同劑量的外源基因時(shí)，公雞產(chǎn)生攜帶有外源基因精子的比率，并以轉(zhuǎn)染率最高的公雞為種公

6、雞，進(jìn)行人工采精、授精，產(chǎn)生下一代，結(jié)果： (1)當(dāng)pEGFP-N1的注射量為50μg、100μg、150μg和200μg時(shí)，48h后取出睪丸經(jīng)二酶三步法分別提取組織、分離細(xì)胞并進(jìn)行涂片檢測(cè)，在熒光顯微鏡下均可見綠色熒光表達(dá)，其比率分別為4.0％、8.7％、10.2％和13.6％，四者之間差異顯著。(2)分別采用50μg、100μg、150μg和200μg劑量的pEGFP-N1注射公雞睪丸，并在術(shù)后的不同時(shí)段對(duì)公雞進(jìn)行精液檢測(cè)。

7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在術(shù)后第25d，精子中綠色熒光表達(dá)率為分別為2.2％、2.3％、2.1％和2.2％，四者差異不顯著；在術(shù)后第32d，精子中綠色熒光表達(dá)率分別為6.7％、7.9％、8.7％和9.0％。術(shù)后39d～160d，每次在同一時(shí)間檢測(cè)，隨著注射劑量的增加，精子中綠色熒光的表達(dá)率也隨之提高。(3)注射pEGFP-N1后，精子中綠色熒光的表達(dá)率隨時(shí)間的推移逐漸提高，在注射后第70d～160d之間表達(dá)率趨于穩(wěn)定：在注射劑量為50μg的公雞精

8、子中pEGFP-N1的表達(dá)率為12.2％～12.7％；注射劑量為100μg時(shí)表達(dá)率為12.1％～12.8％；注射劑量為150μg時(shí)表達(dá)率為15.6％～15.9％；注射劑量為200μg時(shí)表達(dá)率為18.7％～19.1％。(4)對(duì)注射200μgpEGFP-N1的公雞進(jìn)行人工采精、授精，檢測(cè)受精蛋中胚盤的熒光表達(dá)率，在73.08％的胚盤中觀察到表達(dá)綠色熒光。在孵化不同時(shí)期，取不同雞胚胎的心、肝、腎、性腺四種組織器官及全胚進(jìn)行熒光檢測(cè)，綠色熒光陽(yáng)