重組腺相關(guān)病毒神經(jīng)肽Y基因轉(zhuǎn)染對海人酸致癇大鼠海馬突觸重建的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、癲癇是由各種原因?qū)е碌哪X細(xì)胞群異常放電所致的突然性、反復(fù)性和短暫性的神經(jīng)功能失常為特征的綜合征。中國目前至少有700多萬癲癇患者,在美國也大約有80多萬人在忍受藥物難治性癲癇的疾病折磨。在過去的30年里,全世界有近30000中藥物被用來進(jìn)行癲癇治療的動物實(shí)驗(yàn),以此來提高人類臨床治療癲癇的發(fā)展,多年的研究已經(jīng)取得了良好的效果,使一部分癲癇患者通過藥物治療能夠得到緩解,但仍有部分癲癇患者對藥物治療無效,或者不能阻止這些藥物難治性癲癇的發(fā)作和

2、進(jìn)展。目前藥物難治性癲癇的外科手術(shù)治療,也不能完全改變腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的高興奮狀態(tài)和相關(guān)離子通道的異常,同時,外科手術(shù)的局限性仍然只能使少部分癲癇患者從中受益,大部分患者仍然依賴長期的規(guī)范的藥物治療。隨著對該癲癇發(fā)病機(jī)制研究的進(jìn)一步深入,以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基因治療作為一種新的治療手段為有效控制和徹底治愈癲癇帶來了新的希望。
　　 在對癲癇發(fā)病機(jī)制的研究中,海馬突觸重建被認(rèn)為與顳葉癲癇發(fā)作關(guān)系密切,而在海馬異位突觸的重建過程中

3、,苔蘚纖維出芽(mossyfibersprouting,MFS)是突觸重建的重要標(biāo)志,同時伴隨突觸素(synaptophysinP38)以及突觸生長相關(guān)蛋白的異常表達(dá),而這種異位突觸的形成又反過來加重了癲癇的發(fā)作。
　　 在對突出重建后新生突觸的超微結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn),新生突觸在癲癇持續(xù)狀態(tài)下,新生突觸的形態(tài)、數(shù)量、結(jié)構(gòu)、以及功能均區(qū)別于正常腦組織的神經(jīng)突觸,這些新生的突觸形成的是興奮性神經(jīng)環(huán)路還是抑制性環(huán)路,也受到了廣泛關(guān)注。顯微

4、結(jié)構(gòu)顯示這些新生的異位突觸大部分是非對稱性突觸,而這是典型的興奮性突觸的特征。因此苔蘚纖維出芽與顆粒細(xì)胞形成的異位突觸被認(rèn)為是誘發(fā)癲癇發(fā)作的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 在對癲癇藥物治療多年的研究中發(fā)現(xiàn),神經(jīng)肽Y(neuropeptideY,NPY)作為神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng),中樞神經(jīng)系統(tǒng)中海馬內(nèi)濃度最高。NPY及其受體與癲癇的發(fā)生以及苔蘚纖維出芽關(guān)系密切,且外源性NPY具有抗癲癇作用。但NPY在癲癇模型

5、中對神經(jīng)功能的作用非常復(fù)雜,常因動物模型不同或給藥途徑的不同出現(xiàn)不一致甚至相互矛盾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　 本研究以重組腺相關(guān)病毒作為載體,將NPY基因轉(zhuǎn)染到腦組織特定靶區(qū),觀察其對海人酸(Kainicacid,KA)致癇大鼠癲癇發(fā)作的影響,并進(jìn)一步運(yùn)用Timm染色、PCR、免疫印跡等方法,觀察分析重組腺相關(guān)病毒基因轉(zhuǎn)染的NPY(rAAV2/1-NPY-EGFP)對海馬CA3區(qū)苔蘚纖維出芽、突觸素表達(dá)、突觸生長相關(guān)蛋白(GAP-43)

6、的影響,以及利用透射電鏡觀察rAAV2/1-NPY-EGFP治療對致癇大鼠海馬突觸超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　 第一部分，重組腺相關(guān)病毒神經(jīng)肽Y基因轉(zhuǎn)染對海人酸致癇大鼠癲癇發(fā)作及海馬苔蘚纖維出芽的影響
　　 目的:
　　 探討重組腺相關(guān)病毒神經(jīng)肽Y(rAAV2/1-NPY-EGFP)基因轉(zhuǎn)染對癲癇發(fā)作程度和海馬苔蘚纖維出芽的影響。
　　 方法:
　　 清潔級健康Wistar大鼠30只,體重250～270

7、g,隨機(jī)分成NPY實(shí)驗(yàn)組(n=12),海人酸致癇組(KA)(n=12)和對照組(n=6)。NPY實(shí)驗(yàn)組:腦室注射10μl的rAAV2/1-NPY-EGFP,滴度為5×1011μg/ml;KA組在腦室內(nèi)注射等量的生理鹽水。以上兩組10min后分別在海馬CA3區(qū)注射海人酸(KA);空白對照組依次分別在腦室和CA3區(qū)注射等量的生理鹽水。并分別于注射后2、4周觀察大鼠的癲癇發(fā)作情況,視頻腦電(EEG)癲癇波的頻率和波幅,Timm染色觀察海馬CA

8、3區(qū)苔蘚纖維出芽。
　　 結(jié)果:
　　 1、NPY實(shí)驗(yàn)組大鼠隨觀察時間的延長,發(fā)作程度逐漸減輕,與KA組大鼠相比,于4W時,腦電圖癲癇波放電頻率減少(P＜0.05),波幅降低(P＜0.05)。
　　 2、NPY實(shí)驗(yàn)組苔蘚纖維出芽分級明顯低于對照組。3.空白對照組沒有癲癇發(fā)作,CA3區(qū)苔蘚纖維出芽沒有明顯變化。
　　 結(jié)論:
　　 rAAV2/1-NPY-EGFP基因轉(zhuǎn)染可以降低海馬CA3區(qū)苔蘚纖維

9、出芽程度,有效抑制癲癇發(fā)作,為NPY基因治療臨床難治性癲癇提供了有力試驗(yàn)支持。
　　 第二部分，重組腺相關(guān)病毒神經(jīng)Y基因轉(zhuǎn)染對海人酸致癇大鼠海馬突觸素表達(dá)的影響
　　 目的:
　　 觀察rAAV2/1-NPY-EGFP基因轉(zhuǎn)染對突觸素表達(dá)的影響,探討癲癇治療的新方法
　　 方法:
　　 清潔級健康Wistar大鼠,體重250～270g,隨機(jī)分成NPY實(shí)驗(yàn)組(n=24),海人酸致癇組(KA組)(n=

10、24)和對照組(n=24)。NPY實(shí)驗(yàn)組:腦室注射10μl的rAAV2/1-NPY-EGFP,滴度為5×1011μg/ml;海人酸致癇組和對照組分別在腦室內(nèi)注射等量的生理鹽水。10min后分別在NPY試驗(yàn)組及海人酸致癇組大鼠的海馬CA3區(qū)注射海人酸(Kainicacid,KA);對照組在CA3區(qū)注射等量的生理鹽水。注射后2、4周三組大鼠分別取12只,斷頭取海馬組織,分別應(yīng)用熒光定量PCR和western-blot方法觀察突觸素(P38)

11、表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、NPY實(shí)驗(yàn)組大鼠與海人酸致癇組(KA組)大鼠相比,4W后前者發(fā)作程度明顯減輕,差異有顯著性,對照組無癲癇發(fā)作。
　　 2、4W后突觸素(P38)表達(dá)的PCR結(jié)果和Western-blot結(jié)果顯示,在NPY實(shí)驗(yàn)組和海人酸致癇組大鼠之間存在明顯差異(P＜0.05),而2W時差異性不明顯。
　　 結(jié)論:
　　 rAAV2/1-NPY-EGFP基因轉(zhuǎn)染可以降低海馬突觸

12、素(P38)的表達(dá),從而抑制突觸重建的發(fā)生,有效抑制癲癇的發(fā)作。
　　 第三部分，重組腺相關(guān)病毒神經(jīng)Y基因轉(zhuǎn)染對海人酸致癇大鼠海馬突觸生長相關(guān)蛋白GAP-43表達(dá)的影響
　　 目的:
　　 觀察rAAV2/1-NPY-EGFP基因轉(zhuǎn)染對突觸生長相關(guān)蛋白GAP-43表達(dá)的影響,探討癲癇治療的新方法
　　 方法:
　　 清潔級健康Wistar大鼠,體重250～270g,隨機(jī)分成NPY實(shí)驗(yàn)組(n=48)

13、,海人酸致癇組(KA組)(n=48)和對照組(n=48)。NPY實(shí)驗(yàn)組:腦室注射10μl的rAAV2/1-NPY-EGFP,滴度為5×1011μg/ml;海人酸致癇組和對照組分別在腦室內(nèi)注射等量的生理鹽水。10min后分別在NPY試驗(yàn)組及海人酸致癇組大鼠的海馬CA3區(qū)注射海人酸(Kainicacid,KA);對照組在CA3區(qū)注射等量的生理鹽水。注射后2、4周三組大鼠分別取12只,斷頭取海馬組織,分別應(yīng)用免疫組化學(xué)方法和westen-bl

14、ot方法觀察GAP-43表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 NPY實(shí)驗(yàn)組大鼠與海人酸致癇組(KA組)大鼠相比,4W后突觸生長相關(guān)蛋白GAP-43表達(dá)的PCR結(jié)果和Western-blot結(jié)果顯示,在NPY實(shí)驗(yàn)組和海人酸致癇組大鼠之間存在明顯差異(P＜0.05),而2W時差異性不明顯。
　　 結(jié)論:
　　 rAAV2/1-NPY-EGFP基因轉(zhuǎn)染4W后降低了海馬突觸生長相關(guān)蛋白GAP-43的表達(dá),從而抑制了突

15、觸重建的發(fā)生。
　　 第四部分，重組腺相關(guān)病毒神經(jīng)Y基因轉(zhuǎn)染對海人酸致癇大鼠海馬苔蘚纖維出芽突觸超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 目的:
　　 探討重組腺相關(guān)病毒基因轉(zhuǎn)染NPY對苔蘚纖維出芽形成的突觸超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　 方法:
　　 清潔級健康Wistar大鼠,體重250～270g,隨機(jī)分成NPY實(shí)驗(yàn)組(n=24),海人酸致癇組(KA組)(n=24)和對照組(n=24)。NPY實(shí)驗(yàn)組:腦室注射10μl的r

16、AAV2/1-NPY-EGFP,滴度為5×1011μg/ml;海人酸致癇組和對照組分別在腦室內(nèi)注射等量的生理鹽水。10min后分別在NPY試驗(yàn)組及海人酸致癇組大鼠的海馬CA3區(qū)注射海人酸(Kainicacid,KA);對照組在CA3區(qū)注射等量的生理鹽水。分別于注射后2、4周取海馬組織;采用Timm染色標(biāo)記出芽苔蘚纖維末端,在電鏡下觀察新生的突觸數(shù)量、突觸囊泡密度、以及突觸間隙變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、海人酸致癇后苔

17、蘚纖維出芽形成的新生突觸主要以非對稱性突觸為主,非對稱性突觸數(shù)量增加,重組腺相關(guān)病毒NPY基因轉(zhuǎn)染后4W,非對稱性突觸數(shù)量減少,與致癇組對比,差異有顯著性;
　　 2、海人酸致癇組突觸間隙模糊增寬,重組腺相關(guān)病毒NPY基因轉(zhuǎn)染后4W,突觸間隙接近正常,兩組相對比差異有顯著性;
　　 3、海人酸致癇組突觸囊泡突觸囊泡減少,形態(tài)不規(guī)則,密度不均勻,重組腺相關(guān)病毒NPY基因轉(zhuǎn)染后4W,突觸囊泡數(shù)密度(synapticvesic

18、lesdensity,SVD)接近正常,與致癇組對比差異有顯著性;
　　 4、海人酸致癇組以及NPY基因轉(zhuǎn)染后2W神經(jīng)元在電鏡下顯示為:細(xì)胞核腫脹、核仁消失;線粒體空泡變性、線粒體嵴和膜溶解、分界不清;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆?，F(xiàn)象,以上數(shù)據(jù)和對照組以及NPY基因轉(zhuǎn)染4W組相比,差異有顯著性(P＜0.05),海人酸致癇組和NPY基因轉(zhuǎn)染組2W之間對比,無顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 非對稱性突觸是海人酸致癇大鼠海馬苔蘚