人類補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子殼聚糖納米微囊混合物體外及體內(nèi)的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝病是目前威脅人類健康的主要疾病之一，由于各種肝病導(dǎo)致的急、慢性肝功能衰竭，所致病死率高達(dá)70％～80％，多項(xiàng)研究表明，治療急性肝功能衰竭及終末期肝病唯一有效手段是肝臟移植，但由于供體來源困難，在很大程度上限制了肝移植技術(shù)的廣泛應(yīng)用。異種肝臟移植是目前該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)課題，而應(yīng)用該方法移植的主要障礙是超急性排斥(Hyperacuterejection，HAR)，其本質(zhì)是人類補(bǔ)體激活所造成的供體器官不可逆損傷、破壞。人類自身存在許多補(bǔ)體調(diào)

2、節(jié)因子(complementregularfactor，CRF)，其中最有效的有衰變加速因子(decayacceleratingfactor，DAF)、CD59、膜輔助蛋白(membranecofactorprotein，MCP)。它們之間相互作用，一起有效控制補(bǔ)體的活化，保護(hù)宿主細(xì)胞免受補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷。 本課題組自2001年以來一直從事肝臟非病毒載體基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的研究，曾利用納米微囊(nanosphere)包裹Lucifera

3、se報告基因，成功地制備出納米微囊-報告基因復(fù)合體，通過體內(nèi)、外轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞，對合成的載體進(jìn)行了體內(nèi)外的初步生物評價，認(rèn)為殼聚糖(chitosan，CS)可以有效地介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在此研究基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建人類CRF(DAF、CD59、MCP)真核表達(dá)載體，制備CS-DNA納米微囊混合物，并進(jìn)行了一系列體內(nèi)、外的初步實(shí)驗(yàn)研究，以期觀察人類DAF、CD59、MCP對異種細(xì)胞的保護(hù)作用，并為下一步的人工肝臟研究打下基礎(chǔ)。 目的:通

4、過CS納米微囊載體進(jìn)行人類CRF(DAF、CD59、MCP)的體外及體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染，并觀察人類DAF、CD59、MCP對異種組織細(xì)胞的保護(hù)作用。 方法:構(gòu)建人類DAF、CD59、MCP真核表達(dá)載體pSecTag2/HygroB-DAF、pSecTag2/HygroB-CD59、pSecTag2/HygroB-MCP；利用CS組裝成納米微囊混合物，體外轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞系(NIH3T3)細(xì)胞24h，免疫組織化學(xué)法檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)水

5、平；用含有5％、10％人血清的DMEM分別培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染CS-DNA(CS-DAF、CS-CD59及CS-MCP)納米微囊混合物的NIH3T3細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，MTT比色法檢測細(xì)胞活性，同時結(jié)合形態(tài)學(xué)及細(xì)胞增殖活性比較，對CS的毒性進(jìn)行探討；CS-DNA納米微囊混合物經(jīng)耳緣靜脈注射，體內(nèi)轉(zhuǎn)染新西蘭兔48h，利用免疫組織化學(xué)法檢測肝臟轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，同時結(jié)合形態(tài)學(xué)及細(xì)胞增殖活性比較，對CS的毒性進(jìn)行探討；進(jìn)行離體肝臟灌注

6、實(shí)驗(yàn)研究，為下一步DAF、CD59、MCP基因轉(zhuǎn)染離體異種肝臟的研究打下基礎(chǔ)。 結(jié)果:DAF基因大小為1049bp，MCP基因大小為1065bp，CD59基因大小為312bp，與genbank中記載的人DAF、MCP和CD59cDNA序列結(jié)果基本相同?？笵AF/CD59/MCP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染CS-DAF/CS-CD59/CS-MCP納米微囊混合物后的NIH3T3細(xì)胞、兔肝組織均呈現(xiàn)彌漫性陽性，其中轉(zhuǎn)染24h的NI

7、H3T3細(xì)胞的陽性部位主要位于細(xì)胞質(zhì)；轉(zhuǎn)染48h的兔肝組織陽性部位主要位于細(xì)胞核。在形態(tài)學(xué)上，轉(zhuǎn)染CS-DNA納米微囊混合物后的肝組織及NIH3T3細(xì)胞，較轉(zhuǎn)染前無明顯差別；在細(xì)胞增殖活性上，轉(zhuǎn)染CS-DNA納米微囊混合物的肝組織及NIH3T3細(xì)胞，較轉(zhuǎn)染前略有增高。MTT比色法結(jié)果顯示：未轉(zhuǎn)染CS-DNA混合物的各分組，經(jīng)5％、10％人血清DMEM培養(yǎng)的活細(xì)胞數(shù)，較常規(guī)含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)組明顯減少(P＜0.01)；10％人血

8、清DMEM培養(yǎng)組的活細(xì)胞數(shù)明顯低于5％人血清DMEM培養(yǎng)組(P＜0.01)；轉(zhuǎn)染CS-DNA混合物的各分組間，存活細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P＞0.05)；經(jīng)5％、10％人血清DMEM培養(yǎng)的兩個分組之間，存活細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P＞0.05)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：未轉(zhuǎn)染CS-DNA納米微囊混合物的NIH3T3細(xì)胞經(jīng)常規(guī)含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)，細(xì)胞凋亡率為0.8％；轉(zhuǎn)染CS-DNA納米微囊混合物的細(xì)胞經(jīng)5％人血清、10％人血清DMEM培養(yǎng)，細(xì)

9、胞凋亡率為1.3％及1.8％；經(jīng)5％、10％人血清DMEM培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率分別為20％和46.9％；經(jīng)10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染CS-DNA納米微囊混合物NIH3T3細(xì)胞，凋亡率為1％。不同時間下，離體灌注的肝臟HE染色結(jié)果顯示：與正常肝組織相比，灌注后2h肝細(xì)胞即出現(xiàn)糖原消耗現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)淡染、出現(xiàn)空泡樣變；4h肝細(xì)胞糖原消耗進(jìn)一步加重，細(xì)胞質(zhì)空泡樣變更為明顯，且發(fā)生空泡樣變的細(xì)胞數(shù)目明顯增多，甚至偶見小灶狀的肝

10、細(xì)胞壞死；8h肝細(xì)胞壞死灶逐漸增多，局部肝板斷裂；16h壞死灶明顯增大，肝板廣泛斷裂；24h肝細(xì)胞廣泛壞死，但細(xì)胞核殘存；32h肝細(xì)胞廣泛凝固性壞死，細(xì)胞核消失。 結(jié)論:成功構(gòu)建了人類DAF、CD59、MCP真核表達(dá)載體pSecTag2/HygroB-DAF、pSecTag2/HygroB-CD59、pSecTag2/HygroB-MCP。CS是一種較為有效、安全、無毒的非病毒類DNA載體，對細(xì)胞的增殖活性不會造成很大的影響。利

11、用CS轉(zhuǎn)染組織、細(xì)胞24h，主要呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，可能與細(xì)胞攝取CS-DNA納米微囊后形成內(nèi)涵體，并從內(nèi)涵體釋放入細(xì)胞質(zhì)有關(guān)；轉(zhuǎn)染48h，主要呈現(xiàn)細(xì)胞核陽性，說明CS-DNA納米微囊可以在細(xì)胞核內(nèi)大量聚集。通過靜脈注射可以有效地將CS-DNA混合物轉(zhuǎn)染肝臟組織。人血清對小鼠NIH3T3細(xì)胞具有明顯的殺傷及誘導(dǎo)凋亡的作用，10％人血清殺傷作用明顯高于5％人血清，可能與高濃度血清中含有的補(bǔ)體成分含量增多有關(guān)。利用CS將人類DAF、CD59、M