Dickkopf-1的真核表達載體構(gòu)建及其對SHG-,44-的作用.pdf

1、目前認為，人腦惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生的假說是多階段基因突變學說，即其發(fā)生是一個多階段逐步演變的過程，細胞通過一系列進行性的改變逐漸變成惡性，在這種克隆性演化過程中，常積累一系列的基因突變，可涉及不同染色體上的不同基因的變化，因此尋找新的腫瘤相關(guān)基因，并對其主要的異常信號通路進行干預(yù)，將可能有效的治療腫瘤。Dickkopf-1(DKK-1)基因是作為胚胎時期頭部形成的誘導(dǎo)子和Wnt信號傳導(dǎo)通路的抑制因子首次被發(fā)現(xiàn)，并且在不同的惡性腫瘤中作用不一。

2、目前國內(nèi)外關(guān)于DKK-1在膠質(zhì)瘤發(fā)病過程的作用及機理研究較少，因此我們通過體外轉(zhuǎn)染DKK-1于人腦膠質(zhì)瘤細胞系并對其進行功能研究。 本課題從兩個方面對DKK-1進行研究：①構(gòu)建人源DKK-1的真核表達載體。②體外通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細胞系SHG44，觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后DKK-1對SHG44的生物學活性的影響。 第一部分：人源Dickkopf-1真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 目的：構(gòu)建人源Dickkopf-1(DKK-1

3、)基因的真核表達質(zhì)粒，為進一步研究DKK-1的生物學功能奠定基礎(chǔ)。 方法：Trizol法從人新鮮胎盤組織中抽提總RNA，RT-PCR法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板擴增人源DKK-1的基因序列，將經(jīng)NHeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的真核表達載體pcDNA3.1和DKK-1的PCR產(chǎn)物用T4連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌后經(jīng)菌落PCR，NHeⅠ和EcoRⅠ雙酶切及基因測序鑒定。 結(jié)果：RT-PCR法從人胎盤中擴

4、增出816bp大小的目的片段，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后經(jīng)菌落PCR同樣擴增出816bp大小的目的片段，NHeⅠ和EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒均能切出兩條相應(yīng)目的條帶，測序后與genebank中DKK-1的cDNA進行對比，證明DKK-1的基因序列完全正確。 結(jié)論：成功構(gòu)建了pcDNA3.1-DKK-1重組質(zhì)粒，為研究人源DKK-1的功能奠定了基礎(chǔ)。 第二部分： Dickkopf-1基因的表達及其對SHG44的作用 目

5、的：體外研究轉(zhuǎn)染DKK-1對人腦膠質(zhì)瘤細胞系SHG44的生物學活性的影響。 方法：以Lipofectamine2000介導(dǎo)將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DKK-1轉(zhuǎn)染入人腦膠質(zhì)瘤細胞系SHG44，經(jīng)G418篩選后擴大培養(yǎng)，用PCR、RT-PCR和Westem blot法分別在DNA、mRNA、蛋白水平進行檢測，然后用BCNU處理轉(zhuǎn)染后的SHG44細胞及對照組細胞，經(jīng)AVF+PI雙染后經(jīng)流式細胞儀檢測各組細胞的變化。 結(jié)果：

6、重組質(zhì)粒和空載體轉(zhuǎn)染的SHG44細胞經(jīng)G418篩選及擴大培養(yǎng)后，經(jīng)PCR、RT-PCR、Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞在DNA、mRNA、蛋白水平分別表現(xiàn)出相應(yīng)的明顯條帶，而對照組細胞的DNA和蛋白均未顯示相應(yīng)條帶，在mRNA水平僅表現(xiàn)了微弱條帶。流式細胞術(shù)檢測經(jīng)BCNU處理后的各組細胞的凋亡率發(fā)現(xiàn)：未轉(zhuǎn)染SHG44細胞、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的平均凋亡率分別為1，0％、1.4％、8.0％。 結(jié)論