禽傳染性支氣管炎病毒一步法RT-PCR檢測(cè)試劑盒的研制及應(yīng)用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)對(duì)異硫氰酸胍一步法、Trizol試劑法和RNA抽提試劑盒法三種不同的病毒RNA提取方法做了對(duì)比試驗(yàn)，用紫外光檢測(cè)RNA純度和電泳檢測(cè)RNA的完整性的方法對(duì)三種提取方法作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以找出適合禽傳染性支氣管炎病毒RNA提取方法。結(jié)果表明：三種RNA提取方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明三種方法中，異硫氰酸胍一步法提取的RNA樣品純度不高，且不完整；Trizol試劑法和RNA抽提試劑盒法提取的RNA樣品純度和完整性都較理想，兩者提取效果差異不顯著，考

2、慮到成本的因素，本研究選用Trizol試劑法做為今后的RNA提取方法； 通過(guò)在IBV非結(jié)構(gòu)基因3abc的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物，對(duì)引物的特異性進(jìn)行檢驗(yàn)；建立和優(yōu)化了一步法RT-PCR，在此基礎(chǔ)上組裝成一步法RT-PCR檢測(cè)試劑盒。引物的特異性實(shí)驗(yàn)表明，用該引物對(duì)IBV分離株和IBV標(biāo)準(zhǔn)株檢測(cè)成陽(yáng)性，而對(duì)IBDNA疫苗和雞相關(guān)病原體檢測(cè)呈陰性，陽(yáng)性產(chǎn)物回收后測(cè)序表明，擴(kuò)增出的陽(yáng)性片段為IBV的3abc基因。 通過(guò)對(duì)8株IBV

3、國(guó)內(nèi)分離株和3株國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株以及IBDNA疫苗(S1、M和N三基因混合)和4株雞常見(jiàn)病原體的檢測(cè)來(lái)檢驗(yàn)試劑盒的特異性。結(jié)果表明，試劑盒對(duì)IBV分離株和IBV標(biāo)準(zhǔn)株檢測(cè)成陽(yáng)性，而對(duì)IBDNA疫苗和雞相關(guān)病原體檢測(cè)呈陰性；用試劑盒對(duì)不同濃度的病毒RNA模板進(jìn)行檢測(cè)來(lái)檢驗(yàn)試劑盒的靈敏度結(jié)果表明：試劑盒最低可以檢測(cè)出濃度為10-3ng/μl的IB病毒RNA模板；通過(guò)在試劑盒組裝后的6個(gè)月內(nèi)定期用試劑盒對(duì)IBV毒株、IBDNA疫苗和雞常見(jiàn)病原體的檢

4、測(cè)，來(lái)檢驗(yàn)試劑盒的穩(wěn)定性和重復(fù)性，結(jié)果表明：6個(gè)月后，試劑盒的穩(wěn)定性未下降，具有較好的靈敏度和特異性。 用一步法RT-PCR試劑盒、兩步法RT-PCR和ELISA方法對(duì)人工感染雞進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。結(jié)果表明：試劑盒和兩步法RT-PCR均能特異地檢測(cè)出IBV，試劑盒比兩步法RT-PCR節(jié)省了1.5小時(shí)的檢測(cè)時(shí)間，并節(jié)約了成本，減少了試劑污染的可能。試劑盒和ELISA方法均能特異地檢測(cè)出IBV，試劑盒比ELISA方法提前36小時(shí)檢測(cè)出IB

5、V。 試劑盒對(duì)IBDNA疫苗免疫雞、人工IBV感染雞和自然感染病例進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，試劑盒對(duì)IBDNA疫苗免疫的檢測(cè)全部呈陰性；試劑盒可以對(duì)人工IBV感染雞進(jìn)行早期檢測(cè)；試劑盒對(duì)自然感染病例的檢測(cè)結(jié)果與IBV的分離鑒定結(jié)果一致。 本研究建立的RT-PCR一步法試劑盒對(duì)IBV的檢測(cè)具有快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，相對(duì)于傳統(tǒng)的兩步法RT-PCR更快速和簡(jiǎn)便，相對(duì)于ELISA方法更加適合IB的早期檢測(cè)。通過(guò)在IBV的非結(jié)構(gòu)基因3