烏頭堿中樞神經(jīng)毒性及雙黃連干預(yù).pdf

1、目的:
　　烏頭堿(aconitine，AC)為草烏、川烏等的主要成分，具有較強的神經(jīng)毒性。興奮性遞質(zhì)谷氨酸(glutamate，Glu)和抑制性遞質(zhì)γ氨基丁酸(γ-AminoButyricAcid，GABA)是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用。但迄今為止AC中毒后Glu和GABA的改變及與AC所致神經(jīng)毒性的關(guān)系尚不清楚。雙黃連具有改善AC中毒患者死亡率，作為雙黃連主要成分的黃芩苷能減輕興奮性氨基酸的

2、神經(jīng)毒性作用，表明雙黃連對AC中毒的治療作用機制可能與其神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)有關(guān)，但目前尚不能確定。因此本實驗通過雙黃連干預(yù)的體內(nèi)外實驗，研究AC對神經(jīng)元興奮性遞質(zhì)Glu和抑制性遞質(zhì)GABA含量變化影響，探討雙黃連及其單體黃芩苷對烏頭堿神經(jīng)毒性的干預(yù)作用。
　　方法:
　　1.體外研究采用細(xì)胞增殖試劑（Cell Counting Kit-8，CCK-8）檢測AC對PC12細(xì)胞毒性影響，分析AC對PC12細(xì)胞毒性的量效關(guān)系并建立AC損

3、傷模型，采用雙黃連以及黃芩苷干預(yù)，設(shè)立正常對照組:加入含0.1％二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶劑的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞;雙黃連對照組:選取含有終濃度為50μg/ml雙黃連的完全培養(yǎng)基作為對照處理PC12細(xì)胞;黃芩苷對照組:選取含有終濃度20μM黃芩苷的完全培養(yǎng)基作為對照處理PC12細(xì)胞;烏頭堿組:選取終濃度為100μM烏頭堿處理PC12細(xì)胞24h;烏頭堿和雙黃連共培養(yǎng)組:選取終濃度取終濃度為100μ

4、M烏頭堿和終濃度為50μ g/ml雙黃連共培養(yǎng)PC12細(xì)胞24h;烏頭堿和黃芩苷組共培養(yǎng)組:選取終濃度取終濃度為100μM烏頭堿和終濃度為20μM黃芩苷共培養(yǎng)PC12細(xì)胞24h，采用CCK-8法檢測雙黃連及黃芩苷干預(yù)前后PC12細(xì)胞光密度(Opiticaldensity，OD)的變化;應(yīng)用流式細(xì)胞儀探討PC12細(xì)胞凋亡情況;采用化學(xué)比色法測法以及酶聯(lián)免疫吸附法(Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA

5、)法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中Glu、GABA含量變化。
　　2.體內(nèi)研究應(yīng)用清潔級Sprague dawley(SD)大鼠320只，將大鼠隨機分為6組:空白對照組:注射2ml/Kg的生理鹽水;雙黃連對照組:雙黃連60mg/Kg;黃芩苷對組照組:黃芩苷30mg/kg;染毒組:烏頭堿20μg/Kg;雙黃連干預(yù)組:注射烏頭堿后予以30、60 mg/kg雙黃連;黃芩苷干預(yù)組:注射烏頭堿后予以15、30 mg/kg黃芩苷。觀察大鼠染毒1、6、12、

6、24h腦組織病理變化，細(xì)胞凋亡和Glu、天門冬氨酸(Aspartate，Asp)、GABA、甘氨酸(Glycine，Gly)含量變化。
　　結(jié)果:
　　1.體外研究結(jié)果表明，和正常對照組相比，100μM AC處理PC12細(xì)胞24h后，OD值明顯降低;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，其中正常對照組中有95.89％為正常PC12細(xì)胞，而烏頭堿處理使損傷的PC12細(xì)胞達(dá)到64.27％，其中早期凋亡達(dá)45.46％;細(xì)胞培養(yǎng)液中Glu和GAB

7、A釋放量增加(P＜0.05)。與烏頭堿組相比，雙黃連和黃芩苷干預(yù)組OD值顯著升高;凋亡檢測結(jié)果顯示，早期的凋亡比例分別降低至33.24％和28.22％;細(xì)胞培養(yǎng)液中Glu量減少和GABA水平顯著增高(P＜0.05)。
　　2.體內(nèi)研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，染毒組興奮性氨基酸遞Glu與Asp含量，凋亡計數(shù)細(xì)胞顆粒顯著升高(P＜0.05);染毒后1h后大鼠腦額葉皮質(zhì)GABA、Gly水平較空白組顯著下降(P＜0.05)，6，12

8、h含量明顯上升，24h后水平開始下降，但仍維持相對相對較高的水平。和染毒組相比，雙黃連、黃芩苷干預(yù)組GABA、Gly水平升高，Glu與Asp含量明顯降低，腦額葉皮質(zhì)凋亡數(shù)目顯著降低(P＜0.05)，以30 mg/kg黃芩苷干預(yù)組為明顯。光鏡和電鏡所見，染毒組在染毒后12h時間點腦額葉皮質(zhì)損傷最為明顯，雙黃連和黃芩苷干預(yù)后腦額葉皮質(zhì)損傷較染毒組有所減輕。
　　結(jié)論:
　　1.中樞興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的改變可能是烏頭堿所致中樞