微血管改變在壓力超負荷引起的小鼠心力衰竭中的作用及機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、多年來,關于血管新生治療的研究就是全世界范圍的熱點問題。因為缺血是心臟疾病發(fā)病的主要原因之一,因而眾多心臟病科學家也很關注促血管新生能否早日應用于心臟疾病的治療。隨著研究的深入,越來越多的研究證實,促血管新生治療以改善心臟疾病動物模型的心臟功能。許多心臟疾病的終末階段,大多表現(xiàn)為心力衰竭,而促進心力衰竭進展的一個主要原因就是心肌供氧和需氧之間的失衡,也就是血管數(shù)目減少是心力衰竭發(fā)病的一個主要原因。雖然現(xiàn)在的藥物治療可以緩解心力衰竭的癥狀

2、,但是不能完全治愈,若能促進血管新生,來代償性的緩解心肌缺血缺氧的發(fā)病原因,勢必會帶來更好的治療效果。目前,促進血管新生的思路大致有三種,一種是通過把促血管新生因子的基因導入體內(nèi),使得促血管因子表達,增加血管的生成;一個是通過輸入內(nèi)皮細胞等促進血管或心肌生長的細胞,促進血管新生和心肌再生,來改善心臟的重構和功能:還有一種就是直接注入促血管新生因子的蛋白來促進血管新生,改善心臟的氧供,挽救瀕死的心肌。這些策略在動物實驗的心臟疾病模型中都取

3、得了明顯的效果,如VEGF、FGF和HIF-1的促血管因子的治療,以及移植心臟干細胞、內(nèi)皮細胞、骨髓細胞等,都在實驗中顯示了一定的效果。但是也碰到了一些問題,如細胞的鑒定和存活等。
   心力衰竭作為一個常見的疾病和疾病過程,弄清楚心力衰竭發(fā)病的分子機制,進一步闡明其發(fā)生的原因,會給心臟疾病的進展帶來新的方向。結合先前的研究結果,HSF1對心臟有保護作用,但是其具體的機制和作用還沒有完全闡明。我們就HSF1對心力衰竭的影響及其機

4、制做了進一步的研究,以求為心臟疾病的治療提供更清楚的理論基礎。
   第一部分小鼠心肌內(nèi)轉基因后壓力超負荷引起心力衰竭模型的建立
   目的:建立成年小鼠心肌內(nèi)轉基因后壓力超負荷引起的心力衰竭模型,探討手術中關鍵性問題。方法:20只雄性C57BL/6小鼠隨機分為LacZ組和PBS組。首先,他們分別在暫時阻斷主動脈血流0-30s的同時,左心室心腔內(nèi)分別注射100μlAd-LacZ和PBS,飼養(yǎng)兩天后,給予縮窄升主動脈,縮窄

5、程度大于75%。4周后觀察術后小鼠體重、頸動脈血壓和心臟超聲等變化。HE染色和X-gal染色分別觀察心室重構和基因轉染情況。實驗中,同時有假手術組(Sham)作對照。結果:(1)術后一周,TAC小鼠成活率達95%:(2)同Sham組比較,TAC小鼠血壓明顯升高(p<0.01);(3)同Sham組比較,TAC小鼠術后2周心肌明顯肥厚,4周時出現(xiàn)心力衰竭(p<0.01);(4)肉眼和顯微鏡下觀察到,X-gal染色后,LacZ組小鼠阻斷主動脈

6、血流10s以上心臟有藍染,但10s、20s、30s之間無明顯區(qū)別。結論:(1)該方法建立成年小鼠心肌內(nèi)轉基因心力衰竭模型簡單有效,重復性好;(2)左心室心腔直接注射法轉染Ad-LacZ基因,同時阻斷升主動脈血流10s以上,目的基因即可表達良好。
   第二部分過表達p53、VEGF和Angl基因對壓力超負荷引起心室重構和心力衰竭的影響
   目的:觀察過表達p53、VEGF和Ang1基因對壓力超負荷引起的心室重構和心力衰

7、竭過程的影響,尋找其發(fā)病機制及治療方法。方法:將小鼠分成三組:p53組、VEGF+Ang1組和PBS組,用開胸心腔直接注射方法,分別轉染腺病毒攜帶的p53、VEGF+Ang1基因和PBS,轉染第2天,縮窄升主動脈,每周做心臟超聲檢測心臟功能和形態(tài)變化,分別于縮窄主動脈后第2天、1周、2周和4周末測量右側頸動脈壓后取材,用HE染色、Masson三色染色、TUNEL和免疫組化觀察心臟形態(tài)變化和新生血管生成情況,用RT-PCR和Western

8、 blot檢測p53、VEGF和Angl表達情況。結果:(1)從第2周開始PBS組左室射血分數(shù)開始下降,同PBS組比較,p53組下降更明顯,且小鼠死亡率升高,VEGF+Ang1組未出現(xiàn)左室射血分數(shù)下降,未見到死亡小鼠(組間對比p<0.05);(2)2-14天,縮窄升主動脈的小鼠心室壁厚度和新生血管數(shù)逐漸升高達高峰,14-28天逐漸降低,但同PBS組比較,p53組在每一個時期都顯著降低,VEGF+Ang1組與之相反(組間對比p<0.05)

9、;(3)在2-28天,縮窄升主動脈的小鼠心肌細胞凋亡數(shù)目逐漸增多,但同PBS組比較,P53組在每一個時期都顯著增多,VEGF+Ang1組都顯著減少(組間對比p<0.05);(3)p53、VEGF和Angl蛋白在各自轉染組表達升高(組間對比p<0.05)。結論:P53/VEGF和Ang1分別通過減少/增加新生血管的生成,參與了壓力超負荷導致心室重構和心力衰竭發(fā)生發(fā)展的過程,加劇/延緩了心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。
   第三部分熱休克轉錄

10、因子1對壓力超負荷引起心室重構和心力衰竭的作用及機制的研究
   目的:探討熱休克轉錄因子1(heat shock transcription factor1,HSF1)對壓力超負荷引起的心室重構和心力衰竭發(fā)生發(fā)展的影響及其機制。方法:實驗動物分成4組:HSF1基因敲除小鼠(Knockout組)、野生型小鼠(Wild-type組)、HSF1轉基因小鼠(Transgiene組)和假手術小鼠(Sham組),小鼠經(jīng)縮窄升主動脈后,每周

11、做心臟超聲檢測心臟功能和形態(tài)變化,分別于第1周、2周和4周末測量右側頸動脈壓后取材,用HE染色、Masson染色和Ⅷ因子相關抗原免疫組化染色觀察心臟形態(tài)變化和新生血管生成情況,用Western blotting檢測磷酸化Akt和RT-PCR檢測缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)mRNA的表達情況。結果:(1)在0d-14d,縮窄升主動脈的小鼠心室壁厚度值和新生血管數(shù)逐漸升高達高峰,14d

12、-28d,逐漸降低,但同Wild-type組比較,Knockout組在每一個時期都顯著降低,Transgene組都顯著升高;(2)Knockout組小鼠左室射血分數(shù)第1周就開始下降,Wild-type組小鼠從第2周開始下降,而Transgene組未見到有下降;(3)磷酸化Akt和HIF-1mRNA在Knockout組顯著降低,Transgene組顯著升高;心臟纖維化和死亡率在Knockout組顯著升高,Transgene組顯著降低。

13、r>   結論:HSF1通過調(diào)控血管新生,改善了壓力超負荷引起的心室重構和心力衰竭,其中調(diào)控HIF-1的表達可能起著重要作用。
   第四部分熱休克轉錄因子1對小鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的作用及機制的研究
   目的:探討熱休克轉錄因子1(heat shock transcription factorl,HSF1)對心肌微血管內(nèi)皮細胞增殖的影響及其機制。方法:選用HSF1基因敲除小鼠(Knockout組)、野生型小鼠(Wi

14、ld-type組)、HSF1轉基因小鼠(Transgene組)三種成年小鼠,用植塊法培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細胞,用Ⅷ因子相關抗原免疫組化染色鑒定內(nèi)皮細胞的純度,用特制硅膠牽張板培養(yǎng)后并用特制牽張器牽張24h,用CCK-8方法檢測牽張前后細胞增殖能力的變化,用RT-PCR檢測牽張前后缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)和p53mRNA的表達情況,并在Matrigel上培養(yǎng)細胞,觀察牽張前后血管形

15、成能力的變化。結果:(1)植塊法培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細胞,純度可達99%以上;(2)牽張后,三組內(nèi)皮細胞的增殖能力升高、HIF-1和p53mRNA表達增加、形成血管能力增強;(3)牽張前,同Wild-type組比較,Knockout組內(nèi)皮細胞增殖能力下降、p53mRNA表達增加、HIF-1mRNA表達下降、形成血管數(shù)目減少,而Transgene組內(nèi)皮細胞增殖能力升高、p53mRNA表達下降、HIF-1mRNA表達升高、形成血管數(shù)目增多。牽

16、張后,仍有同樣的趨勢;結論:HSF1可以促進心肌微血管的增殖和形成血管的能力,其中上調(diào)HIF-1和下調(diào)p53的表達可能起著重要作用。
   結論:
   1.建立了心肌內(nèi)轉基因后的壓力超負荷小鼠心力衰竭模型;
   2.P53/VEGF和Ang1分別通過減少/增加新生血管的生成,參與了壓力超負荷導致心室重構和心力衰竭發(fā)生發(fā)展的過程,加劇/延緩了心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。
   3.HSF1通過調(diào)控血管新生,改善

17、了壓力超負荷引起的心室重構和心力衰竭,其中上調(diào)HIF-1和下調(diào)p53的表達可能起著重要作用。
   4.HSF1可以促進心肌微血管的增殖和形成血管的能力,其中上調(diào)HIF-1和下調(diào)p53的表達可能起著重要作用。
   潛在價值和創(chuàng)新點:
   1.建立了心肌內(nèi)轉基因后的壓力超負荷小鼠心力衰竭模型;
   2.P53/VEGF和Ang1分別通過減少/增加新生血管的生成,參與了壓力超負荷導致心室重構和心力衰竭發(fā)

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