壓力超負荷大鼠心室肌細胞bax、bcl

1、<p>　　壓力超負荷大鼠心室肌細胞Bax、Bcl</p><p>　　作者：羅承鋒，黃衍壽，劉月嬋，冼紹祥，洪永敦，劉煜德 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 心室肌細胞 </p><p>　　摘要：【目的】觀察腹主動脈縮窄造成的壓力超負荷大鼠模型左心室肌細胞B細胞淋巴瘤/白血病基因蛋白(Bcl2蛋白)及其家族成員Bax蛋白表達的序列變化?！痉椒ā繅毫?/p>

2、超負荷大鼠各時間點(造模后1、4、7、10、21、30、40d)Bax、Bcl2蛋白的表達用流式細胞儀進行胞內(nèi)抗原定量檢測?！窘Y(jié)果】在腹主動脈縮窄之后第1天，大鼠左心室肌細胞Bax蛋白的表達率較高(6375%)，Bcl2蛋白的表達率則較低(3145%)，Bax/Bcl２較高(202)；在以后的觀察點中，Bax蛋白的表達率變化不大，波動于50%～60%之間，而Bcl2蛋白的表達則于第7天升至最高值(7175%)，爾后開始下降，第30天時其

3、表達率最低(228%)；Bax/Bcl2于第4天時下降，第7天時降至最低，隨后開始逐漸上升，第30天達到峰值(24)，到第40天時又下降。【結(jié)論】腹主動脈縮窄造成的壓力超負荷大鼠模型左心室肌細胞凋亡發(fā)生的高峰可能在造模后的第30天。 </p><p>　　關(guān)鍵詞：細胞凋亡；心力衰竭，充血性/病因?qū)W；疾病模型，動物；大鼠 </p><p>　　Bing在1994年就提出細胞凋亡是慢性壓力超負

4、荷導(dǎo)致心力衰竭的機制的假說［１］。越來越多的證據(jù)表明，壓力超負荷時存在著心肌細胞凋亡。B細胞淋巴瘤/白血病基因蛋白(Bcl2蛋白)及其家族成員Bax蛋白在細胞凋亡的調(diào)控過程中起著重要的作用。筆者對壓力超負荷大鼠心室肌細胞Bax、Bcl2蛋白的表達規(guī)律進行了研究。 </p><p><b>　　1 材料與方法 </b></p><p><b>　　11 動物及

5、分組 </b></p><p>　　普通級SD大鼠24只，雌性，體重180～220g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，隨機分為8組，即大鼠造模后第1、4、7、10、14、21、30、40d 8個時間點，每組各3只。 </p><p>　　12 主要器材與試劑 </p><p>　　牙用不銹鋼絲(上海牙科醫(yī)械廠，批號：K41701)；分析天平(LIBROR

6、 AEU210，Shimadzu)；抽濾器(NALGENE,Nalge Company)；離心機(LD52A，北京醫(yī)用離心機廠)；光學(xué)顯微鏡(BH2，Olympus)；流式細胞儀(EPICS ALTRA，Beckman Coulter)。Ficoll(Sigma,華美生物工程公司分裝，批號：38H0588)；多聚甲醛(廣州化學(xué)試劑廠，批號：99010136)；小鼠抗大鼠Bax Ab4(6A7)(Neomarkers，批號：714P010

7、)；小鼠抗大鼠Bcl2α Ab4(10C4)(Neomarkers，批號：598P111)；藻紅蛋白(RPE)標(biāo)記的羊抗小鼠F(ab′)2IgG(Serotec，批號：280901)；封閉用羊血清(北京中山生物技術(shù)有限公司，批號：ZLI9021)；RPE標(biāo)記的羊F(ab′)2IgG(Southern Biotechnology Associate Inc，批號：J366W490B)。 </p><p>　　13

8、心衰模型的復(fù)制 </p><p>　　以腹主動脈縮窄法復(fù)制大鼠左心室壓力超負荷模型［２］。給大鼠腹腔注射100g&#12539;L－１水合氯醛，劑量35mL&#12539;kg－１，麻醉后，暴露腹主動脈，并于雙側(cè)腎動脈上方鈍性分離腹主動脈，用4號縫合線將腹主動脈和與腹主動脈平行放置的外徑約06～09mm的牙用不銹鋼絲一并結(jié)扎，然后輕輕取出不銹鋼絲，使腹主動脈截面積縮窄至原來的25%～30%左右，造

9、成腹主動脈狹窄，關(guān)腹。假手術(shù)組，鈍性分離腹主動脈后，縫合線僅繞于腹主動脈上，并不縮窄，且在術(shù)后3d內(nèi)給予肌肉注射青霉素(18000U&#12539;kg－１），以預(yù)防感染。 </p><p><b>　　14 取材 </b></p><p>　　大鼠稱體重(mbody)后，麻醉，開胸，迅速取出心臟，分別稱取整個心臟質(zhì)量(mheart)及左心室的質(zhì)量(mLV)，

10、將左心室剪成兩塊，用針將心肌穿孔；置于含600mL&#12539;L－１甘油的DMEM(Dulbeccos Modified Eagle Medium)的凍存管中，程序冷凍，最后保存于液氮中備用。 </p><p>　　15 心肌細胞的分離與純化［３］ </p><p>　　從液氮中取出保存的心臟，迅速放入40℃水浴中解凍；用DMEM清洗心臟；將左心室剪碎成1mm３的小塊，于Kre

11、bsHenseleit液中吹打10min以分離心肌細胞，必要時可重復(fù)1次；將含心肌細胞的溶液用100目網(wǎng)篩過濾，800r/min離心5min，01mol&#12539;L－１磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，800r/min離心5min；將沉淀輕輕加入40g&#12539;L－１的Ficoll上，400r/min離心4min，棄上清，沉淀即為高純度的桿狀的心肌細胞。 </p><p>　　16 Ba

12、x、Bcl2蛋白的檢測［４，５］ </p><p>　　將所分離出的心肌細胞計數(shù)，各取1×１０６個細胞，分別加入4支試管中；40g&#12539;L－１多聚甲醛固定60min，1500r/min離心，棄上清，PBS清洗2次；將細胞重懸于10mL&#12539;L－１ Tween80中30min,1500r/min離心，PBS清洗3次；每管加入封閉用羊血清100μL,20min，5mL&a

13、mp;#12539;L－１ Tween80清洗1次，PBS清洗2次；每試管中加入100μL 1∶100的小鼠抗大鼠Bax或Bcl2抗體，室溫下孵育30min，加入5mL&#12539;L－１ Tween80孵育5～10min，1500r/min離心，PBS清洗2次；每試管中加入5μL RPE標(biāo)記的羊抗小鼠抗體或10μL RPE標(biāo)記的羊抗小鼠的同型對照，室溫下孵育30min，加入5mL&#12539;L－１Tween80孵

14、育5～10min，1500r/min離心，PBS清洗2次；各試管中加入PBS 400μL，待上機檢測。 </p><p>　　使用ALTRA流式細胞儀進行Bax和Bcl2蛋白的檢測，結(jié)果用Bax、Bcl2的表達率和平均熒光強度表示。 </p><p><b>　　2 實驗結(jié)果 </b></p><p><b>　　21 造模結(jié)果 &

15、lt;/b></p><p>　　24只大鼠中死亡8只，死亡大鼠均于3d內(nèi)死于急性左心衰，解剖發(fā)現(xiàn)雙肺明顯瘀血，部分還伴有胸腔積液，其死亡與急性壓力超負荷有關(guān)。 </p><p>　　22 各時間點大鼠心臟質(zhì)量變化 </p><p>　　從圖1和圖2可以看出，大鼠在造模后心臟質(zhì)量(mheart)、左心室的質(zhì)量(mLV)逐漸增加，第30～40天之間，其增幅有所

16、減少；心臟、左心室質(zhì)量與體重之比，即心臟質(zhì)量指數(shù)(CMI，IＣＭ＝mheart/mbody)、左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI，IＬＶ＝mLV/mbody)，亦隨時間的延長而增加，約于第30天達到最高值，可能與后負荷增加引起的代償性肥厚有關(guān)，到第40天時，二者的比值已開始降低。 </p><p>　　23 各時間點心肌細胞中Bax、Bcl2的表達情況 </p><p>　　從圖3～5可以看出，在腹

17、主動脈縮窄后第1天，大鼠左心室心肌細胞Bax蛋白的表達率較高(6375%)，第4天已下降，在以后的時間中，其表達率變化不大，波動于50%～60%之間；Bcl2蛋白的表達率于第1天時較低(3145%)，隨后上升，第7天升至最高值(7175%)，爾后開始下降，第30天時其表達率最低(228%)；RBax/RBcl2于第1天時較高，第4天時已下降，第7天時降至最低，隨后開始逐漸上升，第30天達到峰值(24)，到第40天時又下降，兩者熒光強度比

18、值的序列變化基本與表達率之比相似，其第1天的變化可能與突然的壓力超負荷有關(guān)。 </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　心臟的壓力超負荷情況下，心臟首先代償性地向心性肥厚，隨后，心肌細胞增長，心室腔的擴大，心室?guī)缀涡螒B(tài)的變化，心肌細胞外間質(zhì)發(fā)生膠原沉積和纖維化，即心室重塑，最終因失代償而發(fā)生心衰，在此過程中心功能的進行性惡化可能與心肌細胞凋

19、亡有關(guān)［１，６］。細胞凋亡受到程序控制，Bcl2和Bax是Bcl2家族中的重要成員，Bcl2蛋白抑制細胞凋亡，而Bax蛋白則促進細胞凋亡。Bcl2、Bax蛋白可形成同源二聚體，也可相互間形成異源二聚體，Bcl2與Bax的比例(RBcl2/RBax)決定細胞是否發(fā)生凋亡，盡管細胞內(nèi)這一比例是固定的，但外界刺激可以改變抑制凋亡的Bcl2Bax與促進凋亡的BaxBax的量發(fā)生改變。隨著Bcl2表達的增多，BaxBax分開，形成Bcl2Bax異

20、源二聚體，若細胞中50%的Bax與Bcl2形成異源二聚體，即凋亡受抑；若80%的Bax以同源二聚體的形式存在，則細胞容易發(fā)生凋亡［７］。研究顯示，當(dāng)RBax/RBcl2＞2時，細胞凋亡，反之則存活。也有研究表明，Bcl2和Bax可獨立地調(diào)節(jié)細胞凋亡。本文對腹主動脈縮窄引起的壓力超負荷大鼠心室肌細胞表達Bax和Bcl2蛋白的規(guī)律進行了研究</p><p><b>　　參考文獻： </b><

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