壓力超負(fù)荷大鼠心肌能量狀態(tài)對NPY受體亞型表達(dá)的影響.pdf

1、背景：高血壓病是最常見的心血管疾病之一，壓力超負(fù)荷心肌同時面臨心肌重構(gòu)(Ventricular Remodeling)和能量代謝重構(gòu)(Metabolic Remodeling)。壓力超負(fù)荷型心肌的能量代謝是處于相對負(fù)平衡狀態(tài)，表現(xiàn)為高能磷酸鍵物質(zhì)ATP、磷酸肌酸（PCr）減少，ADP/ATP比值升高，葡萄糖氧化占優(yōu)勢，而脂肪酸氧化明顯減少。神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y, NPY)是腦和心臟組織內(nèi)表達(dá)最豐富的肽類物質(zhì)， NPY主

2、要通過與其受體相結(jié)合而發(fā)揮作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)， NPY是能量代謝調(diào)控和動物攝食最重要的基因之一。Y1、Y2和Y5是NPY調(diào)節(jié)動物攝食行為的關(guān)鍵受體，在下丘腦，負(fù)能量平衡是促進(jìn)NPY釋放的主要因素，并通過Y1、Y5受體促進(jìn)攝食，并且優(yōu)先攝取碳水化合物，Y2受體在其中的作用則正好相反?；贜PY及其受體亞型對下丘腦能量代謝調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)與壓力超負(fù)荷心肌能量代謝特點(diǎn)的相似性，而我們的前期研究工作發(fā)現(xiàn)，NPY具有促心肌細(xì)胞肥大的作用，通過Y1

3、、Y5受體刺激心肌肥大，Y2受體則抑制心肌肥大，在發(fā)生肥大的心肌中各受體表達(dá)存在差異性。NPY受體亞型在肥大心肌中表達(dá)的差異性是否受壓力超負(fù)荷心肌能量代謝狀態(tài)的影響，目前還未見報(bào)道。我們設(shè)想，壓力超負(fù)荷致心肌能量代謝狀態(tài)的變化導(dǎo)致NPY受體亞型差異性表達(dá)，NPY通過其受體的差異性作用，同時參與了壓力超負(fù)荷時心肌的能量代謝調(diào)控和心肌重構(gòu)。本研究分為三個部分：
　　第一部分：壓力超負(fù)荷大鼠心肌能量狀態(tài)變化對NPY受體亞型表達(dá)的影響。<

4、br>　　目的：觀察2天、7天、14天壓力超負(fù)荷大鼠心肌能量代謝狀態(tài)以及NPY受體亞型Y1、Y2、Y5表達(dá)、心肌肥大的動態(tài)變化，分析心肌能量代謝狀態(tài)、NPY受體亞型和心肌肥大之間的關(guān)系。
　　方法：⑴以腹主動脈部分縮窄法建立大鼠壓力超負(fù)荷模型，分為：假手術(shù)組（Sham）和腹主動脈部分縮窄手術(shù)組（AAC）,再分2天、7天、14天組；采用無創(chuàng)尾動脈血壓計(jì)檢測大鼠收縮壓和心率，超聲心動儀測定大鼠左心室形態(tài)和功能，心臟組織學(xué)檢測心肌細(xì)胞橫

5、截面積、血管周圍纖維化、心肌間質(zhì)纖維化；⑵采用化學(xué)發(fā)光法檢測心肌組織ADP/ATP比值；⑶采用real-time PCR法檢測Y1、Y2及Y5受體mRNA的表達(dá)量；⑷采用蛋白印跡法(Western-blot)檢測Y1、Y2及Y5受體蛋白含量；⑸采用免疫組化法檢測Y1、Y2及Y5受體在心肌中的分布和表達(dá)量。
　　結(jié)果：①AAC組大鼠術(shù)后2天、7天、14天血壓進(jìn)行性升高，與各時間點(diǎn)Sham組大鼠比較，收縮壓顯著升高，P<0.05。各時

6、間點(diǎn)AAC組大鼠心率與Sham組比較，顯著升高，P<0.05。HW/BW（全心重量mg/體重g）于14天明顯升高，與Sham組比較， P<0.05。LVW/BW（左心室重量mg/體重g）于7天、14天升高，與Sham組比較， P<0.05，說明LVW/BW較HW/BW更敏感。IVST的變化與LVW/BW結(jié)果一致，心肌細(xì)胞橫截面積的變化與HW/BW一致，但各組心肌纖維化均不明顯。說明壓力超負(fù)荷模型建立成功，AAC術(shù)后2、7天心肌未發(fā)生肥大

7、，處于壓力超負(fù)荷早期階段，14天心肌具有肥大的特征，已經(jīng)進(jìn)入壓力超負(fù)荷代償階段。②AAC組大鼠術(shù)后2天、7天、14天ADP/ATP的比值較各時間點(diǎn)Sham組大鼠顯著升高，P<0.05，隨時間延長逐漸降低，到14天時明顯下降，說明壓力超負(fù)荷心肌早期耗能、耗氧較代償期更高。③AAC組大鼠2天、7天、14天心肌Y1、Y2和Y5受體mRNA和蛋白的表達(dá)一致，免疫組化顯示各受體亞型分布于心肌細(xì)胞胞膜、胞漿，壓力超負(fù)荷早期即2天、7天，心肌組織mR

8、NA和蛋白的表達(dá)是升高的，至14天代償期則下降，與各時間點(diǎn)Sham組大鼠比較，P<0.05。
　　結(jié)論：⑴AAC術(shù)后2天、7天心肌未發(fā)生肥大，處于壓力超負(fù)荷早期階段，14天已經(jīng)發(fā)生肥大，進(jìn)入壓力超負(fù)荷代償階段。⑵AAC術(shù)后早期心肌耗能增加，處于明顯的能量負(fù)平衡狀態(tài)，到14天時已經(jīng)出現(xiàn)代償和適應(yīng)性的變化。⑶AAC術(shù)后早期Y1、Y2、Y5受體的mRNA和蛋白表達(dá)升高，至14天出現(xiàn)心肌肥大時表達(dá)下降，與心肌ADP/ATP比值變化趨勢一致

9、。
　　第二部分：能量負(fù)平衡對心肌細(xì)胞NPY受體亞型表達(dá)的影響及其機(jī)制。
　　目的：觀察能量負(fù)平衡對心肌細(xì)胞 Y1、Y2、 Y5受體表達(dá)量的影響以及用 AMPK激動劑AICAR預(yù)處理后的變化；通過檢測磷酸化AMPK蛋白以及AMPK的下游調(diào)控基因ACC磷酸化水平，探討上述生物學(xué)改變的信號調(diào)控機(jī)制。
　　方法：⑴新生SD乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)；⑵分別以AngII10-6M,AICAR0.5M,Compound C1μM,AICA

10、R0.5M+AngII10-6M刺激離體培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞；⑶其余檢測方法同第一部分。
　　結(jié)果：①ANGII、Compound C可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ADP/ATP比值升高，給予AICAR預(yù)處理后，ADP/ATP比值下降；說明在體外ANGII、Compound C可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞能量負(fù)平衡；②心肌細(xì)胞在能量負(fù)平衡的狀態(tài)下，Y1、Y2、 Y5受體mRNA和蛋白的表達(dá)量升高，予 AICAR預(yù)處理后，隨著 ADP/ATP比值的下降，Y

11、1、Y2、 Y5受體mRNA和蛋白的表達(dá)量亦下降，P<0.05。③正常情況下僅有部分AMPK-PThr172和ACC-PSer79表達(dá)，在AngII、AICAR的刺激下，AMPK-PThr172和ACC-PSer79活性增強(qiáng)，AngII、AICAR促進(jìn)AMPK-PThr172和ACC-PSer79的激活。Compound C對正常心肌AMPK-PThr172和ACC-PSer79活性有輕微的抑制作用。但AngII組給予AICAR預(yù)處理后

12、兩者的作用并沒有進(jìn)一步加強(qiáng)，較AICAR組活性低，說明AICAR與AngII在激活A(yù)MPK-PThr172水平方面的作用是拮抗的。
　　結(jié)論：⑴AngII、Compound C可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞能量代謝負(fù)平衡，AICAR可以改善這種抑制作用；⑵在心肌細(xì)胞負(fù)能量平衡下，NPY受體亞型Y1、Y2、Y5mRNA和蛋白的表達(dá)是升高的，改善細(xì)胞的能量代謝狀態(tài)，他們的表達(dá)接近基礎(chǔ)水平；⑶心肌能量代謝水平可能通過AMPK途徑來調(diào)節(jié)NPY受體亞型的

13、表達(dá)。
　　第三部分：探討Y1、Y2、Y5激動劑對心肌細(xì)胞糖攝取的調(diào)控作用。
　　目的：研究NPY受體Y1、Y2、Y5激動劑對心肌細(xì)胞糖攝取的影響。
　　方法：⑴新生SD乳鼠心肌細(xì)胞；⑵實(shí)驗(yàn)分組：Control、Y1激動劑10-7M、Y2激動劑10-6M、Y5激動劑10-6M、陰性對照組；⑶心肌細(xì)胞攝取2-NBDG，分別采用熒光顯微鏡檢測熒光強(qiáng)度和流式細(xì)胞儀檢測比較不同組別之間心肌細(xì)胞攝取2-NBDG的差異。⑷采用免疫

14、細(xì)胞化學(xué)的方法檢測GLUT4的表達(dá)和分布。
　　結(jié)果：①熒光成像及流式細(xì)胞儀分析顯示：與對照組比較Y1激動劑可以抑制心肌細(xì)胞糖攝取，Y2激動劑、Y5激動劑可以刺激心肌細(xì)胞糖攝取，P<0.05；②Y1激動劑可以抑制心肌細(xì)胞GLUT4表達(dá)或轉(zhuǎn)位，而Y2、Y5激動劑可以促進(jìn)心肌細(xì)胞GLUT4的表達(dá)或轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論：Y1激動劑通過抑制心肌細(xì)胞 GLUT4的表達(dá)抑制心肌葡萄糖的攝取；Y2、Y5激動劑通過促進(jìn)心肌細(xì)胞GLUT4的表達(dá)促