注射用益氣復(fù)脈調(diào)節(jié)NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號通路緩解慢性心衰的作用研究.pdf

1、目的:明確注射用益氣復(fù)脈對慢性心衰的療效，并從抗炎角度探討益氣復(fù)脈及其有效成分治療心衰相關(guān)機(jī)制，明確中藥抗炎免疫調(diào)節(jié)有效成分，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:（一）動物藥效研究:(1)心衰模型復(fù)制:采用結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支近端的方法建立心力衰竭大鼠模型。造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、益氣復(fù)脈組和陽性藥卡托普利組，只開胸穿線不造模的大鼠為假手術(shù)組。(2)注射用益氣復(fù)脈對心衰大鼠防治作用的實(shí)驗(yàn)觀察:所有動物均于給藥8周后

2、測定心率、心電圖等血流動力學(xué)參數(shù);進(jìn)行心臟外觀及心肌組織切片觀察;腹主動脈取血，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血漿中心衰特異性指標(biāo)BNP含量。(3)觀察益氣復(fù)脈對心衰大鼠炎癥狀態(tài)的影響:腹主動脈取血離心取血清，心肌組織裂解提取總蛋白，采用ELISA分別測定血清及組織中TNF-α、IL-6及IL-1β含量并進(jìn)行比較分析。
　　 （二）活性物質(zhì)篩選:采用超高壓液相色譜/四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜結(jié)合NF-κB轉(zhuǎn)錄活性雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)篩選

3、益氣復(fù)脈中治療心衰的抗炎單體成分。轉(zhuǎn)染試劑PEI將NF-κB和內(nèi)參Renilla熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞內(nèi)，TNF-α刺激細(xì)胞建立炎癥損傷模型。每半分鐘富集益氣復(fù)脈超高壓液相流出液，適量濃度加入到NF-κB過度表達(dá)的HEK293細(xì)胞中，檢測各組分對NF-κB的抑制作用。
　　 （三）活性物質(zhì)抗炎通路確認(rèn):(1)探索益氣復(fù)脈及有效成分對心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)炎癥損傷的保護(hù)作用:TNF-α損傷建立CME

4、Cs炎癥模型，加入益氣復(fù)脈及有效成分孵育后采用ELISA法分別測定細(xì)胞裂解液NF-κB及細(xì)胞上清IL-6及IL-1β含量并進(jìn)行比較分析。(2)探索益氣復(fù)脈及有效成分CMECs炎癥損傷后相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響:應(yīng)用RT-PCR法檢測CMECs中ERK、JNK和P38 mRNA含量的變化并采用ELISA法測定細(xì)胞內(nèi)三種蛋白含量的變化。
　　 結(jié)果:（一）動物藥效研究:(1)注射用益氣復(fù)脈對大鼠心衰具有顯著的防治作用:其可升高因心衰

5、引起的心率過緩，顯著降低心電圖ST段，縮小心衰大鼠的心臟體積及心肌缺血面積，有效改善心肌組織形態(tài)及心功能，與陽性對照藥卡托普利組效果基本相同。(2)注射用益氣復(fù)脈可以改善大鼠慢性心衰的炎癥狀態(tài)，降低炎性細(xì)胞因子水平:慢性心衰大鼠血清及組織中炎性因子TNF-a，IL-1β，IL-6水平明顯高于假手術(shù)組，益氣復(fù)脈能顯著降低TNF-a， IL-1β，IL-6的含量，從而發(fā)揮保護(hù)心肌內(nèi)皮細(xì)胞的作用。（二）活性物質(zhì)篩選:益氣復(fù)脈對HEK293細(xì)胞

6、NF-κB的高表達(dá)具有顯著抑制作用，通過超高壓液相色譜結(jié)合NF-κB轉(zhuǎn)錄活性雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)篩選出益氣復(fù)脈中能夠顯著抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的8種單體成分，分別為人參皂苷Rb1，Rg1， Rf， Rh1， Rc，Rb2，Ro以及Rg3。（三）活性物質(zhì)抗炎通路確認(rèn):(1)益氣復(fù)脈及其主要活性成分對CMECs炎癥損傷模型具有顯著保護(hù)作用，可以降低細(xì)胞裂解液中NF-κB的含量以及細(xì)胞上清IL-1β、IL-6的含量。(2)益氣復(fù)脈及主要活性成分