2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、IRF-4結(jié)合蛋白IBP是新近發(fā)現(xiàn)與免疫突觸形成、T淋巴細胞激活及Th1/Th2極化關(guān)系密切的一個新分子。通過對IBP缺失小鼠的觀察,發(fā)現(xiàn)動物出現(xiàn)SLE樣自身免疫反應(yīng),特征為血清IgG水平明顯升高、自身抗體產(chǎn)生、效應(yīng)T細胞和記憶T細胞積聚,但具體通過何種途徑引發(fā)疾病的機制未明。由于細胞凋亡在多細胞生物發(fā)育、自穩(wěn)態(tài)維持以及免疫保護和免疫調(diào)控中起著重要的作用,多種自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展均與免疫細胞凋亡紊亂及其引發(fā)的免疫自穩(wěn)失衡相關(guān),本研究擬

2、應(yīng)用sinNA技術(shù)構(gòu)建IBP低表達T細胞株,通過研究激活狀態(tài)下凋亡的改變及引起改變的凋亡分子和通路,確定IBP低表達對T細胞凋亡的影響及其作用機制,為闡明IBP缺失引發(fā)自身免疫病的分子機制研究奠定基礎(chǔ)。 主要研究內(nèi)容和結(jié)果 1.IBP siRNA穩(wěn)定表達載體的構(gòu)建 根據(jù)生物信息學(xué)分析,設(shè)計并合成IBP的三對siRNA靶位點序列和一對無關(guān)序列作為陰性對照,構(gòu)建GeneBuster siRNA重組載體。利用firef

3、ly luciferase和renilla luciferase雙熒光報告基因系統(tǒng),將IBP cDNA全長克隆入pTRE-firefly luciferase基因5'端,檢測IBP抑制效率。通過檢測篩選出一條對IBP抑制效率為78%的有效序列(siRNA 178)。 2.建立IBP基因沉默細胞模型 (1)細胞轉(zhuǎn)染:將IBP siRNA 178穩(wěn)定表達載體及陰性對照NC載體轉(zhuǎn)染高表達IBP的人白血病T細胞株Jurkat,利

4、用載體的neo抗性標(biāo)志,用G418的最小死亡劑量篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。 (2)mRNA水平定量方法:利用IBP和管家基因β-actin的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品繪制real timePCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立檢測IBP的real time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法。 (3)蛋白水平定量方法:構(gòu)建IBP原核表達載體PET-32a/IBP及PGEX-KG/IBP,表達純化后以6×his-IBP融合蛋白作為免疫原,GST-IBP重組蛋白作為鑒定抗原

5、,免疫兔制備IBP多克隆抗體,用Westernblotting從蛋白水平對IBP進行定量。 經(jīng)熒光定量PCR和Western blotting檢測,篩選所得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的抑制效率為73%,陰性對照細胞無明顯抑制。 3.IBP在T細胞凋亡中的作用 (1)IBP低表達對TCR方式刺激下細胞增殖的影響:將IBP siRNA表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞命名為J.IBP<'->,陰性對照NC載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞命名

6、為J.NC。用終濃度5μg/ml的固相Anti-CD3、CD28mAb刺激的TCR信號方式作用于細胞使其激活,<'3>H-TdR摻入實驗檢測細胞增殖,結(jié)果顯示陰性對照細胞在此刺激下的增殖受到明顯抑制,J.IBP<'->則未受影響。 (2)IBP低表達對TCR方式刺激下細胞凋亡的影響:用相同的TCR信號方式激活細胞,Annexin-v/PI雙染色法對細胞進行流式檢測。結(jié)果顯示J.NC在此刺激下發(fā)生明顯高于J.IBP<'->的凋亡,

7、分析原因可能是發(fā)生了激活誘導(dǎo)的細胞死亡(activation induced celldeath,AICD),而IBP缺失后對此凋亡產(chǎn)生了抵抗,由此推斷IBP參與正常的細胞激活后凋亡。 (3)IBP所致凋亡途徑的研究:將IBP低表達細胞J.IBP<'->與高表達FasL的肝癌細胞SW480共培養(yǎng),觀察細胞的凋亡變化。SW480通過混合培養(yǎng)能觸發(fā)淋巴細胞發(fā)生Fas途徑凋亡,J.IBP<'->與SW480細胞共培養(yǎng)24h后,PI染色

8、經(jīng)流式檢測,發(fā)現(xiàn)IBP低表達后細胞凋亡率明顯降低。由此推測,IBP通過Fas凋亡途徑參與細胞的正常凋亡,進而在免疫自穩(wěn)調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。此外,將包含IBP基因全長的pEGFP-C1/hIBP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T中,細胞激活后觀察到有部分細胞的IBP由胞漿轉(zhuǎn)運到核,提示IBP可能具有轉(zhuǎn)錄因子活性,參與Fas或Fas途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 綜上所述,本研究應(yīng)用siRNA技術(shù)構(gòu)建IBP低表達T細胞株,通過研究激活狀態(tài)下凋亡的改

9、變發(fā)現(xiàn)IBP低表達后能抵抗Fas途徑的凋亡,由此推出IBP通過Fas途徑參與T細胞激活后凋亡的調(diào)控。Fas介導(dǎo)的T細胞凋亡在免疫自穩(wěn)、免疫調(diào)控等各種過程中均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,它可使免疫細胞的活化增殖和機體的免疫應(yīng)答維持在一定的限度,避免發(fā)生過度免疫反應(yīng)損傷機體,使機體的免疫系統(tǒng)處于平衡狀態(tài),進而參與免疫自穩(wěn)的調(diào)節(jié),故IBP在免疫自穩(wěn)中發(fā)揮重要作用。其作用機制可能是作為轉(zhuǎn)錄因子進入核內(nèi)參與調(diào)控Fas或相關(guān)基因的表達。本研究對于了解IB

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