特異性置換肽對(duì)銀屑病動(dòng)物模型作用的研究.pdf

1、銀屑病是一種發(fā)病率高、易反復(fù)、治療困難的慢性炎癥性皮膚病，角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)的過度增殖為其顯著特點(diǎn)。雖然銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但一定的遺傳背景、感染作為誘因、以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫紊亂是其發(fā)病機(jī)理中的三個(gè)主要環(huán)節(jié)。角蛋白(keratin)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞骨架的中間纖維家族的主要成員之一，是上皮組織的細(xì)胞骨架成份，也是上皮組織的標(biāo)記蛋白。角蛋白17(K17)是I型角蛋白，在正常表皮不表達(dá)，是銀屑病皮損高表達(dá)的標(biāo)記蛋白，并且與鏈球菌

2、M蛋白具有交叉抗原特性，可特異刺激銀屑病T細(xì)胞使之活化、釋放IFN-γ等炎癥因子，而后者又能夠誘導(dǎo)增加CKRT17的表達(dá)，使機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)CKRT17的自身免疫反應(yīng)，從而在CKRT17和T細(xì)胞之間形成了一個(gè)相互促進(jìn)的惡性環(huán)路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和KC異常增生等病理改變，是銀屑病發(fā)病機(jī)理中的重要環(huán)節(jié)。CKRT17的特異性置換肽(APL)是一種利用氨基酸替換技術(shù)來修飾具有免疫原性的肽而獲得的，它在不影響肽原有的與特定MHC結(jié)合能力的基礎(chǔ)上而發(fā)揮免疫

3、調(diào)節(jié)作用。 本研究在以往細(xì)胞和器官水平上篩選得到CKRT17的置換肽的基礎(chǔ)上，構(gòu)建置換肽的GST融合表達(dá)載體pGEX-4T-S12E，利用還原型谷胱甘肽及尿素濃度梯度透析法獲得較高純度的APL，觀察APL上清對(duì)銀屑病動(dòng)物模型的治療作用，為進(jìn)一步闡明銀屑病的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)理和研究銀屑病特異性生物治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下： 一、CKRT17的限制性T細(xì)胞表位置換肽的克隆、表達(dá)和純化 1.

4、根據(jù)角蛋白17表位S1(118-132)上所對(duì)應(yīng)的置換肽S12E核酸序列，人工合成兩條DNA序列，將其插入到pGEX-4T-1載體相應(yīng)位點(diǎn)之間，構(gòu)建GST融合表達(dá)載體pGEX-4T-S12E，酶切鑒定并測(cè)序。 2.轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，按常規(guī)方法收菌，冰浴中用超聲波破碎細(xì)菌，利用還原型谷胱甘肽及尿素濃度梯度透析法進(jìn)行目的肽段的回收純化，進(jìn)行SDS-PAGE和WesternBlot分析鑒定。 二、單一核細(xì)胞的分離和純化

5、及轉(zhuǎn)移性 制備以淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離銀屑病患者外周血單一核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，分別加入置換肽S12E100μg/mL及10μg/mL、GST蛋白(陰性對(duì)照)，置于5％CO2孵箱37℃培養(yǎng)72h，標(biāo)記后-80℃保存?zhèn)溆谩?三、APL對(duì)豚鼠銀屑病樣動(dòng)物模型的治療作用 1.應(yīng)用5％心得安乳劑制備豚鼠耳廓銀屑病樣皮損模型。 2.將制成的置換肽S12E100μg/mL及10μg/mL、0.

6、1％他克莫司軟膏(陽性對(duì)照)、GST蛋白(陰性對(duì)照)、乳劑基質(zhì)、淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液、CKRT17表位上清七種藥物分組外涂于皮損處連續(xù)20d。將不同時(shí)間的皮損制成組織切片，常規(guī)HE染色。治療前結(jié)果顯示大部分標(biāo)本見到角化過度，顆粒層減少，棘層肥厚，表皮突延伸呈棒狀，乳頭上伸呈杵狀，4毛細(xì)血管擴(kuò)張。治療后表皮趨于正常。 3.PCNA及CKRT17免疫組化染色PCNA免疫組化染色見陽性細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色。APL組治療作用明顯優(yōu)于陽性對(duì)照組

7、，且APL100μg/mL組治療效果優(yōu)于10μg/mL組和他克莫司組，治療時(shí)間越長，好轉(zhuǎn)的程度越明顯。CKRT17免疫組化染色結(jié)果顯示表皮及毛囊均有CKRT17蛋白表達(dá)，局部外用APL可下調(diào)CKRT17蛋白的表達(dá)，高濃度的APL治療作用更明顯。 4.利用ELISA檢測(cè)不同時(shí)間的豚鼠耳廓血清中IFN-γ的濃度，觀察置換肽對(duì)豚鼠耳廓銀屑病樣皮損的治療作用。其結(jié)果顯示血清IFN-γ的濃度隨著治療時(shí)間的延長而下降。APL100μg/mL