真皮干細(xì)胞(SKPs)對實(shí)驗性銀屑病皮膚模型的治療作用研究.pdf

1、目的：銀屑病作為一種慢性免疫相關(guān)的炎癥性疾病，其病因病機(jī)不清，迄今尚無滿意療法。近年發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞具有免疫調(diào)劑作用，有望治愈銀屑病。源于真皮的干細(xì)胞即皮膚前體細(xì)胞(skin-derived precursors，SKPs)易于取材、來源豐富、無異源性干擾，可成為銀屑病干細(xì)胞移植的重要來源。而目前關(guān)于SKPs對銀屑病的治療尚未見報道。目的：通過構(gòu)建體外銀屑病三維皮膚模型，移植SKPs至銀屑病模型，應(yīng)用組織學(xué)、分子生物學(xué)等方法觀察銀屑病模型移

2、植前后皮膚組織細(xì)胞、炎癥因子及基因表達(dá)的變化，以探討SKPs對銀屑病的治療作用及機(jī)制，為進(jìn)一步體內(nèi)研究SKPs治療銀屑病提供實(shí)驗依據(jù)。
　　方法：1.構(gòu)建體外銀屑病三維皮膚模型：(1)SKPs、角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，KC)、成纖維細(xì)胞(fibroblasts，F(xiàn)Bs)的分離和培養(yǎng)：取新生BALB/c小鼠，分離表皮和真皮，真皮分離的細(xì)胞培養(yǎng)SKPs、FBs;兒童包皮的表皮分離的細(xì)胞懸液培養(yǎng)KC。(2)正常三維皮膚

3、模型的構(gòu)建及鑒定：將獲取的FBs與Ⅰ型鼠尾膠原混合建立三維皮膚真皮結(jié)構(gòu)，然后在其表面接種KC，行氣-液界面培養(yǎng)以構(gòu)建正常三維皮膚模型。采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察皮膚結(jié)構(gòu)和免疫組化染色顯示表皮KC特異性抗體CK10及真皮FBs特異性抗體VIM表達(dá)情況。(3)銀屑病三維皮膚模型的構(gòu)建：在構(gòu)建正常三維皮膚模型的KC培養(yǎng)基中加入腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α

4、)和γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)構(gòu)建銀屑病三維皮膚模型，HE染色觀察銀屑病三維皮膚組織病理學(xué)變化。2.SKPs治療銀屑病三維皮膚：(1)實(shí)驗分組：將成功構(gòu)建的三維皮膚隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、治療組和對照組。(2)SKPs移植到銀屑病三維皮膚：將紅色熒光PKH26標(biāo)記的SKPs移植到治療組，對照組注射Hanks液。(3)標(biāo)本收集：分別收集正常組、模型組造模第3、6、9、12天以及治療組和對照組治療后第3、6天的

5、上清液。同時收集上述4組造模或治療后6天的皮膚組織。HE染色觀察皮膚組織病理學(xué)變化。(4)指標(biāo)檢測：采用ELISA法檢測各組上清液中的IL-1、IL-12、IL-17濃度以及qPCR檢測各組組織IL-1α、IL-12α、IL-17αmRNA表達(dá)水平。3.采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Graphpad Prism6軟件分析數(shù)據(jù)繪圖。
　

6、　結(jié)果：1.原代分離培養(yǎng)的KC和FBs在鏡下為貼壁生長，KC呈鋪路石樣或卵石樣形態(tài)，F(xiàn)Bs呈多角形或菱形外觀;SKPs為懸浮生長，呈圓形或球形克隆樣細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞球中央顏色較深，周圍明亮。2.三維皮膚模型外觀表現(xiàn)：(1)正常三維皮膚表現(xiàn)為白色半透明狀，邊緣整齊無卷曲;(2)銀屑病三維皮膚呈乳白色不透明，邊緣卷曲，較正常三維皮膚縮小變厚。3.三維皮膚模型病理組織學(xué)改變及鑒定：(1)HE染色下，正常三維皮膚由表皮層和真皮層組成，分界清楚;表皮

7、層細(xì)胞排列較整齊、形態(tài)一致;真皮層由少量細(xì)胞和膠原構(gòu)成，結(jié)構(gòu)緊密。(2)銀屑病三維皮膚表皮明顯增厚。(3)免疫組化染色顯示正常三維皮膚表皮細(xì)胞著棕黃色、表達(dá)CK10陽性即為KC;真皮層著深棕黃色、表達(dá)VIM陽性即為FBs，正常三維皮膚模型成功構(gòu)建。4.SKPs移植到銀屑病三維皮膚后其冰凍切片顯示攜帶紅色熒光的SKPs彌散分布于皮膚組織中，并在組織中存活良好。5.SKPs對銀屑病三維皮膚的作用：(1)經(jīng)SKPs移植治療后治療組三維皮膚表皮

8、及棘層明顯變薄;而對照組則改善不明顯。(2)各組上清經(jīng)ELISA檢測后，模型組IL-1、IL-12、IL-17表達(dá)水平較正常組明顯升高(P＜0.05);但經(jīng)SKPs移植后，IL-1、IL-12和IL-17表達(dá)水平較模型組及對照組均明顯降低(P＜0.05);對照組與模型組比較，IL-1、IL-12和IL-17水平降低不明顯(P＞0.05)。(3)各組皮膚組織經(jīng)基因檢測后，模型組表達(dá)IL-1α、IL-12α、IL-17amRNA水平較正常組

9、顯著升高(P＜0.05);然而經(jīng)SKPs移植后，治療組IL-1α、IL-12α、IL-17αmRNA表達(dá)均較模型組和對照組明顯降低(P＜0.05);對照組與模型組比較，IL-1α、IL-12α、IL-17αmRNA水平無顯著降低(P＞0.05)。
　　結(jié)論：1.體外培養(yǎng)的KC、FBs可與Ⅰ型鼠尾膠原成功構(gòu)建正常三維皮膚模型。2.在正常三維皮膚基礎(chǔ)上，持續(xù)加入TNF-α和IFN-γ，可成功建立銀屑病三維皮膚模型，為銀屑病發(fā)病機(jī)制及治