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文檔簡介
1、第一章人非小細胞肺癌EGFRL858R+V834L基因突變原代動物模型構(gòu)建與藥物效果評價
目的:非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)是嚴重威脅人類健康的一類癌癥。近年來,靶向藥物治療成為NSCLC治療的重要手段。表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是一種酪氨酸激酶(tyrosinekinase,TK)受體,在腫瘤細胞增殖、遷移和分化過程中
2、發(fā)揮重要作用。EGFR在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中過表達,過表達與其基因突變密切相關(guān)。EGFR基因突變存在于一部分NSCLC患者,以吉非替尼為代表的EGFR酪氨酸激酶抑制劑對這一部分患者具有良好的治療效果。目前發(fā)現(xiàn)的突變位點多位于EGFR基因外顯子19和21,多數(shù)研究關(guān)注單點突變,且多以細胞為研究模型,不能準確模擬在體環(huán)境。本研究首次建立EGFR蛋白L858R+V834L雙突變位點的皮下移植瘤小鼠模型,并觀察吉非替尼在這一模型中的治療效應(yīng)
3、。
方法:腫瘤標本來源于湖南省長沙市中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院手術(shù)患者,女性,54歲,中-低分化腺癌?;蚍中痛_定其EGFRL858R+V834L雙基因突變陽性。原代腫瘤組織被剪成1.0~1.5mm3大小。雌性SCID小鼠背部皮下選取四個點接種瘤塊,每點兩塊,此為第一代荷瘤小鼠(P1)。當(dāng)某一點的皮下移植瘤直徑大于1cm時,處理小鼠,剝離腫瘤按上述方法接種第二批SCID小鼠(P2),并重復(fù)上述步驟進行腫瘤傳代,建立第三代、第四代荷瘤小
4、鼠。四代小鼠腫瘤組織以EGFR基因突變L858R特異性抗體,采用免疫組織化學(xué)法和免疫印跡方法檢測EGFR表達。DNA從腫瘤組織獲得經(jīng)PCR后產(chǎn)物送測序。第三代小鼠接種后,當(dāng)瘤體直徑達4-5mm時,選取5只小鼠給予吉非替尼治療2周,5只作為溶媒對照,每三天測量腫瘤大小,計算體積,判斷吉非替尼療效。
結(jié)果:1.成功建立移植瘤模型,P1、P2、P3和P4小鼠移植瘤成功率分別為50%、50%、100%和87.5%。
2.免疫
5、組織化學(xué)和免疫印跡法確證,各代移植瘤EGFRL858R蛋白表達均呈陽性。
3.基因測序顯示,各代移植瘤EGFR基因21外顯子均存在L858R+V834L雙突變位點,確證其與原代腫瘤序列一致。
4.吉非替尼治療部分抑制L858R+V834L雙突變移植瘤體的生長。
結(jié)論:本實驗首次成功構(gòu)建EGFR基因L858R+V834L雙突變位點的移植瘤小鼠模型,且基因型在傳代過程中保持一致;該模型對吉非替尼治療敏感,可作為
6、NSCLC患者EGFR基因突變陽性靶向藥物篩選的模型。
第二章人非小細胞肺癌EML4-ALK融合基因原代動物模型及crizotinib獲得性耐藥模型的構(gòu)建
目的:靶向治療是非小細胞肺癌(NSCLC)的重要治療手段,近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種新的治療靶點。ALK(Anaplasticlymphomakinase,間變性淋巴瘤激酶)融合基因,特別是EML4-ALK融合基因是當(dāng)前NSCLC靶向治療的新研究熱點。以Crizotini
7、b為代表的ALK抑制劑在臨床應(yīng)用取得了較好的療效,大多數(shù)ALK融合基因陽性的NSCLC病人對Crizotinib敏感,但最后不可避免地在一年之內(nèi)因出現(xiàn)耐藥而復(fù)發(fā),部分機制不明,還有患者可有多重耐藥出現(xiàn),出現(xiàn)另一些激酶的活化如EGFR和其他酪氨酸激酶受體活性的增加,使得耐藥的具體機制更為復(fù)雜。已知Akt和ERK等信號通路,特別Akt和ERK磷酸化水平與ALK調(diào)控細胞生存與凋亡密切相關(guān),也參與了crizotinib耐藥的發(fā)生。本研究將利用皮
8、下移植瘤技術(shù)建立原代非小細胞肺癌EML4-ALK融合基因小鼠,以此為模型,誘導(dǎo)crizotinib獲得性耐藥的發(fā)生,為尋找新型克服Crizotinib抵抗的ALK抑制劑,為臨床ALK融合基因肺癌Crizotinib獲得性耐藥患者的治療提供實驗依據(jù)。
方法:腫瘤標本來源于湖南省長沙市中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院手術(shù)患者,男性,40歲,左上肺腺癌,低分化。基因分型確定其EML4-ALK融合基因陽性。原代腫瘤組織被剪成1.0~1.5mm3大小
9、。雌性SCID小鼠背部皮下選取四個點接種瘤塊,每點兩塊,此為第一代荷瘤小鼠(P1)。當(dāng)某一點的皮下移植瘤直徑大于1cm時,處理小鼠,剝離腫瘤按上述方法接種第二批SCID小鼠(P2),并重復(fù)上述步驟進行腫瘤傳代,建立第三代荷瘤小鼠。三代小鼠腫瘤組織以ALK特異性抗體,采用免疫組織化學(xué)法和免疫印跡方法檢測ALK表達。RNA從腫瘤組織獲得經(jīng)RT-PCR后產(chǎn)物送測序。第三代小鼠接種后,當(dāng)瘤體直徑達8-9mm時,選取6只小鼠給予Crizotini
10、b治療2周,6只作為溶媒對照,每三天測量腫瘤大小,計算體積,判斷crizotinib療效。另有耐藥組10只持續(xù)給藥6個月誘導(dǎo)耐藥形成,提取腫瘤組織蛋白檢測相關(guān)蛋白磷酸化水平的變化。
結(jié)果:1.成功建立移植瘤模型,P1、P2和P3小鼠移植瘤成功率分別為50%、100%、和86.7%。
2.免疫組織化學(xué)和免疫印跡法確證,各代移植瘤EML4-ALK融合蛋白表達均呈陽性。
3.基因測序顯示,各代移植瘤EML4-AL
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