抗銀屑病藥動物模型的建立及腫瘤壞死因子-受體超家族在銀屑病發(fā)病中的作用探討.pdf

1、銀屑病是一種發(fā)病率較高的紅斑鱗屑性皮膚病，其治療復雜而棘手。其發(fā)病機理尚未完全明確，目前主要認為是遺傳背景下的一種由T細胞介導的自身免疫性疾病。半個多世紀以來，有不同的動物模型被用于研究銀屑病，但都因為僅僅只反映某一方面的機制而無法通用。在Th1/Th2疾病理論體系下，銀屑病中Th1型細胞及其細胞因子占優(yōu)勢，屬于Th1型疾病，尋找一種能體現(xiàn)銀屑病這一免疫學特點的動物模型將對銀屑病的研究具有重大意義。
　　 通過運用豬甲狀腺球蛋白

2、、弗氏佐劑及高碘飲水，我科實驗人員在先前的研究中已經(jīng)成功地在Wistar大鼠身上建立了實驗性自身免疫性甲狀腺炎(experimentalautoimmune thyroiditis，EAT)模型，本研究繼續(xù)采用該方法建立EAT模型，并作了適當改進。以血清抗甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulin antibody，TGAb)水平及甲狀腺組織病理改變評價不同抗銀屑病藥物的療效；分離外周血單一核細胞(peripheral bl

3、ood mononuclear cells，PBMCs)，利用基因芯片技術(shù)高通量、高準確性、高靈敏度的優(yōu)勢，從整體細胞因子免疫網(wǎng)絡(luò)水平對不同抗銀屑病藥物調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡的機理進行研究，并對若干指標以realtime PCR進行驗證。
　　 針對基因芯片發(fā)現(xiàn)的若干腫瘤壞死因子/受體超家族成員的變化，在銀屑病患者身上驗證。Realtime PCR檢測其在外周血及皮損中mRNA表達量，免疫組化檢測皮損中相應(yīng)蛋白的表達水平，從而探

4、討腫瘤壞死因子/受體超家族在銀屑病發(fā)病機理中的可能作用。
　　 第一部分用實驗性自身免疫性甲狀腺炎模型評價抗銀屑病藥物療效的可行性探討
　　 目的:驗證EAT模型的建立方法，研究不同抗銀屑病藥物治療該模型的療效，探討其作為抗銀屑病藥物療效評價活體模型的可行性。
　　 方法:運用豬甲狀腺球蛋白、弗氏佐劑以及高碘(0.05％)飲水在健康Wistar大鼠上建立EAT模型。隨后EAT模型大鼠隨機分成模型組、環(huán)孢素組、依曲

5、替酸組及沙利度胺組，給予相應(yīng)藥物混懸液灌胃治療30天(模型組給予生理鹽水，環(huán)孢素組每天每只給予環(huán)孢素A20.625mg/kg，依曲替酸組給予依曲替酸2.75mg/kg，沙利度胺組給予沙利度胺6.875mg/kg)。同時以正常大鼠(不予灌胃治療)作為正常對照組。建模完成及藥物治療結(jié)束后兩次檢測血清中TGAb抗體水平并觀察甲狀腺組織病理改變。
　　 Realtime PCR法檢測大鼠PBMCs中TNF-α、IL-10mRNA的表達情

6、況。
　　 結(jié)果:建模后模型組大鼠血清中的TGAb抗體水平明顯高于正常組(P＜0.01)，其甲狀腺組織亦發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)。模型組PBMCs中TNF-α mRNA表達水平升高，而IL-10mRNA的表達水平下降(P＜0.01)。經(jīng)環(huán)孢素A、依曲替酸、沙利度胺處理后EAT大鼠TGAb水平明顯降低(P＜0.01)，各治療組間也有顯著差異(P＜0.05)。在甲狀腺炎癥嚴重程度方面，各治療組與正常對照組及模型組相比較有顯著性差異(P＜0

7、.05)，而各治療組間無顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:采用甲狀腺球蛋白、弗氏佐劑及高碘飲水免疫動物，可成功建立EAT模型。EAT大鼠外周血中存在一定程度的Th1偏態(tài)性。環(huán)孢素A、依曲替酸及沙利度胺對EAT大鼠血清TGAb水平均有下調(diào)作用，以環(huán)孢素A最為明顯。EAT與銀屑病都屬于Th1型疾病，他們的若干免疫與細胞因子網(wǎng)絡(luò)具有相似性，若干藥物療效及機理也具有一定相似性。因此，可以把EAT模型作為抗銀屑病藥物療效評價的活體模

8、型，并以環(huán)孢素A作為藥物治療效果的陽性對照，以TGAb水平作為判斷藥物是否起效的檢測指標。
　　 第二部分抗銀屑病藥物對實驗性自身免疫性甲狀腺炎模型Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)機制研究
　　 目的:分析不同抗銀屑病藥物作用前后EAT大鼠PBMCs中Th1-Th2基因表達譜的差異性，尋找不同藥物調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡的相關(guān)基因并分析其可能機制。
　　 方法:將上述各組大鼠PBMCs分離后按組混合，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成

9、cRNA，與OligoGEArray(R) Th1-Th2-Th3基因芯片進行雜交，Scan Array Scanner掃描儀進行掃描，GEArray軟件分析，篩選出不同藥物治療前后表達有差異的基因并作分類分析。部分芯片結(jié)果用realtime PCR進行驗證。
　　 結(jié)果:篩選出三個治療組共同表達基因，有4個基因(Ccr4、Ccr9、Gata3、Glmn)三組共同上調(diào)；有15個基因(CD4、Cxcr3、Cmkbr3、Fosl2、

10、Ifng、IL-18、Nfatc4、Socsl、Stat1、Tbx2l、Tnf、Tnfrsf4、Tnfsf4、Tnfsf5、Tnfsf6)共同下調(diào)。以realtime PCR驗正TNF-α、IL-10、T-bet、Gata3 mRNA表達，與基因芯片結(jié)果吻合。
　　 結(jié)論:各抗銀屑病藥物均能通過上調(diào)Th2相關(guān)基因、下調(diào)Th1相關(guān)基因的表達以調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡。其中趨化因子及其受體，信號轉(zhuǎn)導途徑以及腫瘤壞死因子及其受體超家族等

11、在基因芯片結(jié)果中有顯著變化，可能在銀屑病的免疫反應(yīng)中起著重要的作用。這些研究為深入研究銀屑病發(fā)生、發(fā)展、緩解機制，以及針對這些靶位進行藥物研制開發(fā)提供了理論依據(jù)。
　　 第三部分腫瘤壞死因子/受體超家族在銀屑病發(fā)病中的作用探討
　　 目的:觀察銀屑病患者外周血及皮損中腫瘤壞死因子/受體超家族成員TNF-α、OX40、OX40L及HVEM的表達，探討其在銀屑病發(fā)病中的作用。
　　 方法:以正常人外周血及皮膚為對照，

12、realtime PCR檢測90例尋常型銀屑病患者外周血及20例患者皮損中TNF-α、OX40、OX40L及HVEM mRNA表達，免疫組化檢測皮損中OX40、OX40L蛋白表達水平。
　　 結(jié)果:銀屑病患者皮損及外周血TNF-α mRNA水平增高(P＜0.05)，OX40 mRNA水平在皮損中增高(P＜0.05)，在外周血中無明顯差異(P＞0.05)，而OX40L mRNA水平在外周血及皮損中均降低(P＜0.05)，外周血及皮

13、損中HVEM mRNA表達與正常對照相比無顯著差異(P＞0.05)，皮損中OX40、OX40L蛋白表達均高于正常皮膚(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:腫瘤壞死因子/受體超家族成員TNF-α、OX40、OX40L等在銀屑病的Th1-Th2細胞亞群及細胞因子的調(diào)整、CD4+T細胞的定向遷移等過程中發(fā)揮重要的作用，可望以此為靶位進行免疫治療。實驗中銀屑病患者外周血及皮損中OX40L mRNA水平降低，而HVEM mRNA水平與正常對照相