Eaf2在紫外線誘導(dǎo)小鼠晶狀體細(xì)胞凋亡過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、在世界范圍內(nèi)，白內(nèi)障已經(jīng)成為一種眼科常見(jiàn)疾病，給患者的生活質(zhì)量帶來(lái)了嚴(yán)重的影響。白內(nèi)障的致病因素和發(fā)生發(fā)展的機(jī)制隨著研究的不斷深入而逐漸清晰起來(lái)。如我們所知，紫外線和氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致白內(nèi)障的形成，很多相應(yīng)的機(jī)制和有關(guān)學(xué)說(shuō)因此被提出以解釋晶狀體混濁形成的原因。白內(nèi)障患者可能存在針對(duì)紫外線和氧化應(yīng)激防御的功能缺陷，使損傷因子更加容易地引發(fā)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，這也許成為白內(nèi)障形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。通常情況下，紫外線暴露會(huì)導(dǎo)致晶狀體內(nèi)一系列復(fù)雜地急性

2、或慢性反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)剩的活性氧物質(zhì)比如過(guò)氧化氫和過(guò)氧化物離子?；钚匝醭藭?huì)進(jìn)一步引起晶狀體蛋白質(zhì)降解、交聯(lián)和聚合，同時(shí)還會(huì)引起DNA損傷。接下來(lái)的過(guò)程中，DNA損傷也許會(huì)被修復(fù)，細(xì)胞繼續(xù)存活；也許會(huì)導(dǎo)致程序化的細(xì)胞死亡或凋亡來(lái)清除出現(xiàn)問(wèn)題的細(xì)胞個(gè)體，從而維持晶狀體結(jié)構(gòu)和功能的完整性。但是，如果大量細(xì)胞發(fā)生凋亡或者凋亡的細(xì)胞不能被增生所彌補(bǔ)，就會(huì)影響晶狀體的生理功能，引起一系列病理改變。紫外線是人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢杀苊獾沫h(huán)境因素，與一些皮膚腫

3、瘤和眼科疾病的發(fā)生密切相關(guān)，因此對(duì)紫外線誘導(dǎo)晶狀體細(xì)胞凋亡的研究很可能為揭示白內(nèi)障的病因提供線索。
　　 ELL相關(guān)因子2(ELL-associated factor2，Eaf2)是一種新發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤抑制作用的蛋白質(zhì)分子，人們對(duì)它的認(rèn)識(shí)是從(11；19)(q23；p13.1)轉(zhuǎn)位引起的急性白血病開(kāi)始的。Eaf2具有增強(qiáng)ELL蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)活性的作用，從而加快RNA聚合酶Ⅱ催化的RNA合成反應(yīng)。在一些研究中，人們利用紫外線照射細(xì)

4、胞來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA損傷，結(jié)果顯示原來(lái)彌漫分布在細(xì)胞核內(nèi)的Eaf2重新定位到細(xì)胞核的核仁中，這種特殊的細(xì)胞內(nèi)定位暗示了Eaf2很有可能參與DNA損傷的修復(fù)過(guò)程或者誘發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在一些激素起關(guān)鍵性作用的器官發(fā)生的腫瘤，比如前列腺癌，Eaf2顯現(xiàn)出明顯的抗腫瘤特性。如果將Eaf2轉(zhuǎn)染到人類(lèi)前列腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，會(huì)引起宿主細(xì)胞發(fā)生caspase依賴的凋亡。Eaf2作為一種腫瘤抑制劑其腫瘤抑制作用很可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖的方式來(lái)

5、實(shí)現(xiàn)的。而且根據(jù)Min Li等人的報(bào)道，在鼠的胚胎發(fā)育階段就已經(jīng)檢測(cè)到Eaf2的表達(dá)，并推斷Eaf2很可能在晶狀體的發(fā)育、成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。這暗示Eaf2很可能在胚胎發(fā)育階段具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用，并且Eaf2很可能在成熟晶狀體中也存在一定水平的表達(dá)。
　　 目前尚未有實(shí)驗(yàn)對(duì)成熟小鼠晶狀體中Eaf2基因的表達(dá)情況進(jìn)行描述，為此我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常小鼠晶狀體中Eaf2基因在mRNA水平被轉(zhuǎn)錄，這意味著Eaf2蛋白很可能存在于晶

6、狀體細(xì)胞中并且發(fā)揮一定的生理作用。為了明確Eaf2蛋白質(zhì)對(duì)紫外線誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡作用，本課題將從以下幾方面進(jìn)行研究：(1)將構(gòu)建的pEGFP-C1-Eaf2真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到商品化的alpha-TN4小鼠晶狀體上皮細(xì)胞系，并表達(dá)EGFP-Eaf2融合蛋白，利用紫外線輻射誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，觀察Eaf2是否對(duì)細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用。(2)利用Eaf2基因敲除小鼠模型進(jìn)行TUNEL測(cè)試、caspase3蛋白質(zhì)活性測(cè)定，研究Eaf

7、2對(duì)紫外線誘導(dǎo)晶狀體細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。(3)在Eaf2基因敲除小鼠模型中觀察p53蛋白質(zhì)是否會(huì)參與紫外線誘導(dǎo)的晶狀體細(xì)胞凋亡過(guò)程，通過(guò)定量PCR技術(shù)研究Eaf2蛋白質(zhì)是否會(huì)影響p53蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄激活能力，以提高已知的一些下游促凋亡基因的表達(dá)。本研究將為揭示白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制提供新的視角和途徑。
　　 材料與方法
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、細(xì)胞株
　　 alpha-TN4小鼠晶狀體上皮細(xì)胞系為中國(guó)醫(yī)科大

8、學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科晶狀體實(shí)驗(yàn)室提供。
　　 2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 實(shí)驗(yàn)用Eaf2基因敲除小鼠和正常對(duì)照小鼠由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科晶狀體實(shí)驗(yàn)室提供，并且基因敲除小鼠和正常對(duì)照小鼠均由Bm12小鼠構(gòu)建。
　　 二、主要研究方法
　　 1、建立表達(dá)Eaf2蛋白質(zhì)的細(xì)胞系
　　 pEGFP-C1-Eaf2質(zhì)粒和pEGFP-C1空載質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、提純和酶切鑒定，以準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。利用Liposu

9、ction2000轉(zhuǎn)染alpha-TN4細(xì)胞株，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況，明確Eaf2的細(xì)胞內(nèi)定位，并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
　　 流式細(xì)胞儀檢測(cè)紫外線誘導(dǎo)晶狀體細(xì)胞凋亡的比率
　　 紫外線輻射后，收集包括貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞在內(nèi)的總細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。應(yīng)用Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)紫外線誘導(dǎo)的小鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生的情況。
　　 2、紫外線(UV)輻射晶狀體<

10、br>　　 小鼠一只眼暴露于紫外線燈照射下，另一只眼用鉛片制作的眼罩遮擋。290nm-320nm的紫外線輻射總劑量為8kJ/m2，照射時(shí)間15分鐘。
　　 3、觀察晶狀體結(jié)構(gòu)變化
　　 紫外線輻射后24小時(shí)后。乙醚麻醉小鼠，斷頸處死，摘取雙眼(保留視神經(jīng)長(zhǎng)約2cm)。顯微鏡下取出部分小鼠眼球晶狀體，稱(chēng)重。觀察晶狀體標(biāo)本是否透明，是否出現(xiàn)空泡、水裂等混濁的征象。
　　 4、TUNEL測(cè)定組織細(xì)胞凋亡
　　

11、 將整個(gè)眼球固定，60℃石蠟包埋，組織切片厚度為5μm。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，然后水化，過(guò)氧化氫封閉。利用TUNEL試劑盒標(biāo)記組織切片內(nèi)發(fā)生的細(xì)胞凋亡情況，然后顯微鏡下觀察并拍照。
　　 5、caspase3活性測(cè)定
　　 casepase3可以催化底物Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide)產(chǎn)生黃色的pNA(p-nitroaniline)，從而可以通過(guò)測(cè)定其吸光度

12、來(lái)檢測(cè)caspase3的活性。對(duì)小鼠晶狀體蛋白質(zhì)抽提后，進(jìn)行caspase3活性測(cè)定，以便對(duì)凋亡發(fā)生情況進(jìn)行量化體系的比較。
　　 6、Western Blot檢測(cè)p53蛋白的表達(dá)情況
　　 p53蛋白質(zhì)是一種參與細(xì)胞凋亡的重要物質(zhì)，在凋亡內(nèi)部通路中發(fā)揮作用。從小鼠晶狀體中抽提總蛋白質(zhì)后，利用SDS-PAGE電泳以及PVDF轉(zhuǎn)印技術(shù)分離不同分子量的蛋白。封閉，p53一抗孵育過(guò)夜，相應(yīng)二抗孵育，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光，拍照，以β-

13、actin為內(nèi)參，條帶進(jìn)行灰度值分析。
　　 7、RT-PCR和Real time RT-PCR測(cè)定mRNA的轉(zhuǎn)錄水平
　　 使用Trizol吹打組織樣本，氯仿分離總RNA，并使其沉淀。逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR，以研究Eaf2、p53、caspase3、Bid、Bax、Noxa、Puma、Apaf-1基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來(lái)表示。兩樣本間均數(shù)比較采用Independent t test。P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、轉(zhuǎn)染后目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況
　　 在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染EGFP-C1-Eaf2質(zhì)粒的細(xì)胞(Ⅰ組)和EGFP-C1質(zhì)粒的細(xì)胞(Ⅱ組)呈現(xiàn)出綠色的熒光，無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照細(xì)胞未見(jiàn)綠色熒光。在Ⅰ組中，熒光聚集在細(xì)胞核中均勻分布；Ⅱ組中，

15、綠色熒光分布在細(xì)胞質(zhì)中。Ⅰ組的轉(zhuǎn)染效率為47.7±1.8％，Ⅱ組轉(zhuǎn)染效率為48.5±1.5%。
　　 2、體外實(shí)驗(yàn)中Eaf2能夠提高細(xì)胞凋亡率
　　 轉(zhuǎn)染EGFP-C1-Eaf2質(zhì)粒的細(xì)胞(Ⅰ組)接受UV輻射后細(xì)胞凋亡率為26.41±1.95%，未接受UV輻射細(xì)胞凋亡率為16.23±0.82%；轉(zhuǎn)染EGFP-C1質(zhì)粒的細(xì)胞(Ⅱ組)接受UV輻射后細(xì)胞凋亡率為17.73±1.08%，未接受UV輻射細(xì)胞凋亡率為11.33±1.

16、40%。Ⅰ組和Ⅱ組細(xì)胞在接受紫外線輻射后的細(xì)胞凋亡率均顯著高于未接受紫外線輻射時(shí)的數(shù)值(P<0.05)；在相同的紫外線輻射條件下，表達(dá)EGFP-Eaf2融合蛋白的細(xì)胞的凋亡率要高于僅表達(dá)熒光蛋白EGFP的細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)。
　　 3、正常小鼠晶狀體中Eaf2的表達(dá)情況
　　 將總RNA提取物進(jìn)行特異性RT-PCR并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示：Eaf2與對(duì)照基因β-actin的mRNA表達(dá)水平相似。

17、
　　 4、紫外線輻射不會(huì)影響Eaf2的表達(dá)
　　 對(duì)正常小鼠接受紫外線輻射組和正常小鼠未接受紫外線輻射組的樣本進(jìn)行Real time RT-PCR測(cè)定，結(jié)果顯示Eaf2基因的轉(zhuǎn)錄在兩組之間并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 5、晶狀體的宏觀結(jié)構(gòu)沒(méi)有出現(xiàn)特異性改變
　　 紫外輻射并沒(méi)有引起正常小鼠組和Eaf2基因敲除小鼠組內(nèi)各個(gè)樣本出現(xiàn)晶狀體混濁的現(xiàn)象，也沒(méi)有出現(xiàn)水裂、空泡等特征性改變。
　　

18、 6、紫外線輻射誘導(dǎo)晶狀體發(fā)生細(xì)胞凋亡
　　 TUNEL測(cè)試顯示大劑量紫外線輻射會(huì)引起晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象，同時(shí)在未接受紫外線輻射的樣本中幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞。在normal-UV組與Eaf2 K.0.-UV組之間，前者表現(xiàn)出更加顯著的細(xì)胞凋亡水平。
　　 7、Eaf2蛋白質(zhì)會(huì)提高細(xì)胞內(nèi)caspase3表達(dá)量和caspase3蛋白酶活性
　　 通過(guò)Real time RT-PCR定量測(cè)定caspas

19、e3的mRNA表達(dá)情況以及樣本的caspase3活性測(cè)定，結(jié)果顯示：兩種測(cè)試指標(biāo)具有相同的結(jié)果，normal-UV組較normal-nonUV組顯著提高(P<0.05)，Eaf2 K.0.-UV組較Eaf2 K.0.-nonUV組也顯著提高(P<0.05)；并且normal-UV組較Eaf2 K.0.-UV組顯著升高(P<0.05)。
　　 8、p53在紫外線輻射誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞中表達(dá)增加
　　 實(shí)驗(yàn)中p53基因的轉(zhuǎn)錄水平

20、由定量RT-PCR測(cè)定，結(jié)果顯示：normal-UV組較normal-nonUV組p53 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；Eaf2 K.0.-UV組較Eaf2 K.0.-nonUV組p53mRNA表達(dá)水平同樣顯著提升(P<0.05)，并且各組樣本進(jìn)行p53蛋白質(zhì)的Western Blot測(cè)定顯示，接受紫外線照射的正常小鼠組的p53蛋白條帶灰度值比未接受紫外線照射的正常小鼠組明顯提高(P<0.05)；在接受紫外線輻射的基因敲小鼠組

21、和未接受紫外線輻射的基因敲除組之間具有相似的蛋白質(zhì)條帶灰度值增高趨勢(shì)(P<0.05)。
　　 9、Eaf2蛋白質(zhì)未對(duì)p53表達(dá)水平造成影響
　　 在normal-UV組和Eaf2 K.0.-UV組的比較中，p53 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，同時(shí)在兩組間進(jìn)行的Western Blot測(cè)試也顯示了相似的蛋白質(zhì)條帶灰度水平。也就是說(shuō)，Eaf2并沒(méi)有對(duì)p53的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)造成影響。
　　 10、紫外

22、線誘導(dǎo)晶狀體細(xì)胞凋亡過(guò)程中Bid基因、Bax基因和Apaf-1基因的表達(dá)情況
　　 Real time RT-PCR技術(shù)測(cè)定了各組中Bid、Bax和Apaf-1基因的轉(zhuǎn)錄水平，normal-UV組較normal-nonUV組上述三種基因的轉(zhuǎn)錄副本含量顯著提高(P<0.05)，同樣Eaf2 K.0.-UV組較Eaf2 K.0.-nonUV組三種基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)；但是在normal-UV組和Eaf2 K.0.-

23、UV組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 11、紫外線誘導(dǎo)晶狀體細(xì)胞凋亡過(guò)程中Noxa基因和Puma基因的表達(dá)水平比較
　　 定量PCR技術(shù)檢測(cè)了Noxa和Puma基因在各組的表達(dá)差異。normal-UV組與normal-nonUV組比較，Noxa和Puma基因的轉(zhuǎn)錄副本含量顯著提高(P<0.05)；同樣Eaf2 K.0.-UV組與Eaf2 K.0.-nonUV組比較，兩種基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)；

24、而且，normal-UV組和Eaf2 K.0.-UV組比較，Noxa和Puma基因的mRNA表達(dá)水平升高并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、Eaf2蛋白質(zhì)彌漫分布于小鼠晶狀體上皮細(xì)胞alpha-TN4細(xì)胞核內(nèi)，是一種核蛋白。
　　 2、在體外實(shí)驗(yàn)中Eaf2蛋白質(zhì)具有提高紫外線誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡水平的能力。
　　 3、Eaf2基因在正常小鼠晶狀體細(xì)胞中表達(dá)。
　　 4、紫外線