紫外線影響晶狀體上皮細(xì)胞縫隙連接通訊的研究.pdf

1、目的：長(zhǎng)期慢性的紫外線輻射(Ultraviolet Radiation)被認(rèn)為是老年性白內(nèi)障形成的主要原因。有關(guān)紫外線輻射導(dǎo)致白內(nèi)障的機(jī)制還不太清楚,國(guó)內(nèi)外大量學(xué)者已從紫外線對(duì)晶狀體蛋白的氧化損傷及DNA的直接損傷方面探討了紫外線與白內(nèi)障形成的關(guān)系。最近的研究表明,晶狀體在無(wú)氧條件下受紫外線輻射也會(huì)出現(xiàn)離子平衡紊亂。因此,有人認(rèn)為紫外線對(duì)調(diào)控細(xì)胞間離子平衡的膜通道也具有損傷作用?？p隙連接(Gap Junction)介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊(Ga

2、p Junction IntercellularCommunication,GJIC)是細(xì)胞間主要通訊方式,GJIC允許小分子自由通過(guò),調(diào)控細(xì)胞間離子平衡。晶狀體上皮細(xì)胞間GJ是相鄰的晶狀體上皮細(xì)胞間縫隙連接蛋白(Connexin43,CX43)組成的。那么,UVA是否會(huì)對(duì)Connexin43產(chǎn)生某種方式的損傷作用呢?本研究依據(jù)以上推測(cè),探討Connexin43是否是uVA對(duì)晶狀體損傷的潛在靶點(diǎn),同時(shí)觀察UVA對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的這種損傷

3、作用是否是可逆的,進(jìn)一步分析這種損傷作用會(huì)有哪些細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)通路的參與。
　　 材料與方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)、UVA照射及測(cè)定細(xì)胞存活率細(xì)胞選取人晶狀體上皮細(xì)胞SRAO1/04,培養(yǎng)于DMEM。UVA照射強(qiáng)度分別為0、5、10、20、40 J/cm2。細(xì)胞生存率由CCK-8試劑盒測(cè)定,OD450值為不可逆細(xì)胞凋亡比例。并且根據(jù)不同照射強(qiáng)度下晶狀體上皮細(xì)胞存活率,選擇UVA的最適實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度。
　　 2、測(cè)定CX43

4、 mRNA和蛋白含量以及SLDT實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組是按UVA照射和空白對(duì)照分為兩組。同時(shí)UVA停止照射后,會(huì)有不同觀察時(shí)間點(diǎn),我們選取停止照射后的0、1、2、4、8、16小時(shí)。SRA01/04細(xì)胞經(jīng)10 J/cm2 UVA照射后,按照預(yù)先設(shè)定的不同時(shí)間點(diǎn),分別提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,定量real-time PCR測(cè)定細(xì)胞內(nèi)CX43的mRNA含量以及停止照射后mRNA的變化趨勢(shì)。SRA01/04細(xì)胞經(jīng)超聲裂解后,蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜

5、,加入CX43抗體,運(yùn)甩Western-blot方法測(cè)定CX43蛋白含量以及停止照射后的蛋白變化趨勢(shì)。SLDT實(shí)驗(yàn)是為了測(cè)定GJIC活性。SRA01/04細(xì)胞經(jīng)UVA照射后,分別加入熒光素黃(Kuciferyellow,LY)和羅丹明(Rhodamine-dextran,RD)。細(xì)胞經(jīng)手術(shù)刀劃痕后,分別在上述時(shí)間點(diǎn)由多聚甲醛固定,觀察LY和RD的擴(kuò)散速度,經(jīng)熒光顯微鏡數(shù)字成像系統(tǒng)照像。
　　 3、測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧、脂質(zhì)過(guò)氧化程度

6、以及PKC活性SRA01/04細(xì)胞經(jīng)UVA照射后,在上述時(shí)間點(diǎn),運(yùn)用流式技術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的含量及變化趨勢(shì),運(yùn)用MDA檢測(cè)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度及變化趨勢(shì)。同樣的,PKC的活性也經(jīng)由上述干預(yù)因素處理后,運(yùn)用PKC活性檢測(cè)系統(tǒng)Genmed,檢測(cè)PKC活性及變化趨勢(shì)。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法選擇實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和t檢驗(yàn),P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：

7、r>　　 1、不同強(qiáng)度的UVA對(duì)SRA01/04存活率的影響晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04在不同強(qiáng)度的UVA照射后,會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞存活率的改變。細(xì)胞存活率由CCK-8檢測(cè)。當(dāng)UVA照射強(qiáng)度為5 J/cm2時(shí),細(xì)胞存活率約為80％。隨著UVA照射強(qiáng)度的增加,細(xì)胞存活率降低。當(dāng)UVA照射強(qiáng)度為40 J/cm2時(shí),細(xì)胞存活率下降至20％左右。我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)UVA照射強(qiáng)度為10 J/cm2時(shí),細(xì)胞生存率約為46％。因此,我們把10 J/cm2作為U

8、VA的最適照射強(qiáng)度,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2、UVA對(duì)CX43的mRNA和蛋白表達(dá)的影響以及SLDT實(shí)驗(yàn)CX43的mRNA由定量real-time PCR測(cè)定。SRA01/04經(jīng)10 J/cm2UVA照射后,CX43的mRNA明顯比對(duì)照組降低。停止照射1小時(shí)后,CX43的mRNA水平開(kāi)始緩慢升高,并在隨后的2至8小時(shí)持續(xù)升高。停止照射后的16小時(shí),SRA01/04細(xì)胞CX43的mRNA水平恢復(fù)至照射前的基線水平。同樣的,CX43

9、的蛋白也有上述變化。SRA01/04經(jīng)10 J/cm2UVA照射后,CX43蛋白明顯下降。停止照射后1小時(shí),CX43蛋白開(kāi)始緩慢升高,并在隨后的2至8小時(shí)持續(xù)升高。停止照射后的16小時(shí),SRA01/04細(xì)胞CX43的蛋白水平恢復(fù)至照射前的基線水平。這種變化說(shuō)明10 J/cm2 UVA照射對(duì)細(xì)胞CX43的影響是在mRNA和蛋白兩個(gè)水平,而且這種變化是可逆的。檢測(cè)CX43功能的劃痕實(shí)驗(yàn),即SLDT實(shí)驗(yàn)也出現(xiàn)了上述同樣的變化。SRA01/04

10、經(jīng)10 J/cm2 UVA照射后,可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組LY僅在劃痕處的兩側(cè)小范圍內(nèi),而對(duì)照組LY范圍較大,約擴(kuò)散五至六層細(xì)胞。停止照射后,實(shí)驗(yàn)組LY開(kāi)始逐漸擴(kuò)散,約16小時(shí)后,兩組間無(wú)明顯差別。RD因無(wú)法經(jīng)CX43擴(kuò)散至細(xì)胞內(nèi),兩組均觀察到RD停留在劃痕處的兩側(cè)小范圍內(nèi),兩組間始終無(wú)差別。
　　 3、UVA對(duì)ROS、脂質(zhì)過(guò)氧化、PKC的影響我們運(yùn)用流式技術(shù)檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04經(jīng)UVA照射后的胞內(nèi)ROS變化。我們發(fā)現(xiàn)UVA照射

11、可導(dǎo)致胞內(nèi)ROS的急速上升,說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)氧壓力的增加。在隨后的16小時(shí)內(nèi),ROS開(kāi)始下降,提示胞內(nèi)應(yīng)激狀態(tài)有所恢復(fù)。同樣的,我們運(yùn)用MDA檢測(cè)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度。UVA照射后,我們檢測(cè)到超過(guò)80％的MDA的升高。停止照射后的1小時(shí)和2小時(shí),約分別有60％和40％的升高。在停止照射的16小時(shí),脂質(zhì)過(guò)氧化狀態(tài)得以大部分的恢復(fù)。PKC活性在LWA照射后也存在上述變化,UVA照射后,PKC活性約有58％的升高,在隨后的16小時(shí)內(nèi),PKC活性逐漸降

12、低。說(shuō)明LWA引起的PKC活性的變化是可逆的。
　　 結(jié)論：
　　 1、經(jīng)不同強(qiáng)度的UVA照射,可導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04存活率的變化。5 J/cm2至40 J/cm2的照射強(qiáng)度可導(dǎo)到SRA01/04存活率的變化范圍為80％至20％。10J/cm2的UVA照射后,SRA01/04存活率約為46％。我們把10 J/cm2作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最適照射強(qiáng)度。
　　 2、UVA照射可導(dǎo)致CX43的mRNA和蛋白兩個(gè)水

13、平的下降,但是,這種變化是可逆的。UVA照射可導(dǎo)致CX43功能狀態(tài)的變化,SLDT實(shí)驗(yàn)中,LY的擴(kuò)散速率是暫時(shí)的,可逆的。說(shuō)明UVA導(dǎo)致的CX43的功能變化是可逆的。
　　 3、UVA照射可導(dǎo)致SRA01/04細(xì)胞內(nèi)ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化的增加,說(shuō)明UVA照射可以引起氧壓力的變化。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如PKC也參與了UVA照射的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)。更重要的是,以上指標(biāo),ROS、脂質(zhì)過(guò)氧化程度和PKC活性在UVA停止照射后,逐漸復(fù)原。說(shuō)明U