DEC在抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中作用的研究.pdf

1、前言
　　 分化的胚胎軟骨細(xì)胞基因(Differentiated Embryonic Chondrocyte gene,DEC)1(別名BHLHE40/Stral3/Sharp2)和DEC2(別名BHLHE41/Sharp1)屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋類轉(zhuǎn)錄因子。DEC1和DEC2廣泛表達(dá)于多種組織和細(xì)胞中,并參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能。作為重要的生物鐘節(jié)律調(diào)節(jié)因子,有關(guān)DEC在生物鐘節(jié)律調(diào)節(jié)方面的功能已有相當(dāng)報(bào)道,對解釋正常機(jī)體的生理

2、、生化、某些行為現(xiàn)象以及因晝夜節(jié)律紊亂而引發(fā)的病理生理過程,乃至提出相應(yīng)的防治措施等都有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　 除參與生物鐘節(jié)律的調(diào)節(jié)之外,DEC還參與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo),細(xì)胞增殖的調(diào)控,腫瘤的惡性進(jìn)展以及對低氧狀態(tài)的反應(yīng)。有研究表明,在乳腺癌及結(jié)腸癌組織標(biāo)本中,DEC1在癌組織中的表達(dá)顯著高于其在同一標(biāo)本非癌組織中的表達(dá);而在低氧環(huán)境下,DEC2可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular Endothelial Gr

3、owth Factor,VEGF)的表達(dá);DEC對其下游目的基因的調(diào)控主要通過依賴及非依賴E-box的方式進(jìn)行。
　　 關(guān)于DEC在細(xì)胞凋亡過程中的作用也有相應(yīng)報(bào)道,不同的研究甚至得到相反的結(jié)論,如在離子輻射誘導(dǎo)的小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞凋亡過程中,DEC1發(fā)揮促細(xì)胞凋亡的作用;而血清饑餓誘導(dǎo)的人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞凋亡過程中,DEC1具有抑制細(xì)胞凋亡的作用;DEC1同樣參與調(diào)節(jié)經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子(Transformi

4、ng growth factor,TGF-β)誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌細(xì)胞凋亡過程。
　　 紫杉醇(paclitaxel,PTX)是提取自太平洋紫杉樹樹皮的典型紫杉烷類化療藥物。研究表明,紫杉醇可以影響B(tài)cl-2、Bcl-xL的表達(dá)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化、半胱氨酸激酶(caspases)的活化和聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶(PARP)的水解活性,從而誘導(dǎo)依賴或非依賴p53機(jī)制的細(xì)胞凋亡。此外,紫杉醇能抑制細(xì)胞有絲分裂

5、過程中紡錘體的形成,使細(xì)胞阻滯于G2/M期,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 順鉑(cisplatin或CDDP)是另外一種臨床一線抗腫瘤藥物,其抗癌機(jī)制主要是促使DNA雙鏈發(fā)生交聯(lián),從而抑制DNA復(fù)制以及轉(zhuǎn)錄過程而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。CDDP處理可以影響有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAPKs),p53,Bax,Bcl-2,Bcl-xL,Bim,PERIOD(PER)1,PER3的表達(dá)以及caspase的活化和PARP的裂解。迄今為止,在抗腫瘤

6、藥物紫杉醇或順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡過程中,DEC1及DEC2是否發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制還不清楚,有待進(jìn)一步闡明。
　　 本研究目的旨在探討DEC在乳腺癌細(xì)胞系及口腔癌細(xì)胞系中的表達(dá)以及在抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。在細(xì)胞水平上,通過瞬時(shí)干擾或過表達(dá)DEC1及DEC2的表達(dá),分析其對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色技術(shù)探討抗腫瘤藥物對DEC在細(xì)胞內(nèi)定位及表達(dá)的影響。
　　 方法
　　

7、1、細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理
　　 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、人口腔癌細(xì)胞系HSC-3和CA9-22培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,貼壁生長,每3-4天胰酶消化傳代一次。細(xì)胞經(jīng)不同濃度的紫杉醇或順鉑處理2小時(shí)或24小時(shí)。
　　 2、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
　　 使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,利用Rever-Tra Ace進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。設(shè)計(jì)DEC1和DEC2引

8、物,分別用于實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),內(nèi)參分別選擇18s和GAPDH。
　　 3、小干擾RNA(siRNA)及質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染
　　 針對DEC1及DEC2的小干擾RNA由Qiagen合成,使用LipofectamineiMAX轉(zhuǎn)染試劑將小干擾RNA轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中。將DEC1和DEC2的過表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)宿主細(xì)菌DH5a中擴(kuò)增,純化,測序驗(yàn)證后,使用Lipofectamine LTX

9、轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至口腔癌細(xì)胞系HSC-3及CA9-22中,通過Western Blot鑒定轉(zhuǎn)染效率。
　　 4、Western Blot
　　 將含有10μg總蛋白的裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)印至PVDF膜,多克隆抗體DEC1或DEC2于4℃搖床孵育過夜,辣根過氧化酶標(biāo)記二抗室溫條件下孵育1小時(shí)后ECL顯色。
　　 5、免疫熒光染色
　　 細(xì)胞接種于4孔chamber slide中,加入

10、藥物處理24小時(shí)。4%多聚甲醛固定30分鐘后,用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色,加入0.2%Triton X/PBS處理30分鐘,非免疫動物血清封閉30分鐘,一抗為兔抗人多克隆抗體DEC1和DEC24℃孵育過夜;二抗為Alexa488標(biāo)記的抗兔IgG,37℃避光孵育1小時(shí)。共聚焦顯微鏡(Zeiss,LSM710,德國)下觀察熒光信號,并進(jìn)行圖像采集。陰性對照實(shí)驗(yàn):用等量的0.01mol/L PBS代替一抗。
　　 6、MTS法檢測細(xì)胞活

11、力
　　 取對數(shù)生長期的口腔癌細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度3×105個(gè)/ml)分別接種于96孔板培養(yǎng)板,每板分3組:CDDP未處理組、50μMCDDP處理組及100μMCDDP處理組,其中每組又包含轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染DEC2過表達(dá)質(zhì)粒組。于轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加入CDDP繼續(xù)處理24小時(shí),之后每孔加入20μl四甲基偶氮唑鹽化合物[3-(4,5-dime-thylthiazol-2-y1)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2

12、-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt;MTS(a)]試劑,37℃避光孵育1小時(shí)后,測定490nm波長條件下各孔吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　 7、統(tǒng)計(jì)分析
　　 應(yīng)用Student'st-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1、紫杉醇上調(diào)了DEC1和DEC2在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的表達(dá)水平
　　 我們檢測了MCF-7細(xì)

13、胞中,紫杉醇是否影響DEC1及DEC2的表達(dá)。在培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞中加入不同濃度紫杉醇作用2小時(shí)后對DEC1、DEC2蛋白表達(dá)水平及caspase-8和PARP的水解活性無影響。然而,作用24小時(shí)之后,上述蛋白表達(dá)水平顯著增高。50μM濃度的紫杉醇處理24小時(shí)后,p53蛋白表達(dá)水平輕度升高,而Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低。另外,經(jīng)紫杉醇作用24小時(shí)后,DEC1及DEC2的mRNA表達(dá)水平也顯著增高。
　　 2、DEC1表達(dá)缺失與

14、DEC2表達(dá)缺失對紫杉醇誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡具有相反的調(diào)節(jié)作用。
　　 轉(zhuǎn)染siRNA-DEC1下調(diào)DEC1的表達(dá)后,因紫杉醇誘導(dǎo)而增加的caspase-8、PARP的水解活性及p53蛋白的表達(dá)水平受到抑制,而被紫杉醇抑制的Bcl-2蛋白的表達(dá)水平則有所增加。另一方面,無論紫杉醇作用與否,轉(zhuǎn)染siRNA-DEC2下調(diào)DEC2的表達(dá)均增加了caspase-8、PARP的水解活性及p53蛋白的表達(dá)水平,同時(shí)抑制了Bcl-2蛋白的

15、表達(dá)水平。
　　 3、紫杉醇對DEC1及DEC2蛋白亞細(xì)胞定位的影響。
　　 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果表明,經(jīng)紫杉醇處理24小時(shí)后,DEC1蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)水平升高,而DEC2蛋白在細(xì)胞核及細(xì)胞漿中的表達(dá)水平同時(shí)升高。
　　 4、siRNA-DEC2增加了紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞核固縮,siRNA-DEC1減少了紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞核固縮。
　　 細(xì)胞核固縮現(xiàn)象被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的特征之一。我們發(fā)現(xiàn),在經(jīng)紫杉醇處理

16、24小時(shí)后,MCF-7細(xì)胞中出現(xiàn)了細(xì)胞核固縮現(xiàn)象。siRNA-DEC1在一定程度上抑制了紫杉醇誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞核固縮現(xiàn)象。而單獨(dú)轉(zhuǎn)染siRNA-DEC224小時(shí)后,MCF-7細(xì)胞即出現(xiàn)核固縮,同時(shí),siRNA-DEC2增強(qiáng)了紫杉醇誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡。這一現(xiàn)象與Western Blot實(shí)驗(yàn)中顯示的結(jié)果相一致。
　　 5、人口腔癌細(xì)胞系CA9-22和HSC-3中,順鉑對DEC1和DEC2表達(dá)的影響。
　　 采用不同

17、濃度的順鉑分別作用于口腔癌細(xì)胞系CA9-22和HSC-3。我們發(fā)現(xiàn),50μM和100μM濃度的順鉑作用24小時(shí)后,PARP水解活性及BimEL剪切體的活性增強(qiáng),但是卻降低了CA9-22細(xì)胞中內(nèi)源性DEC1和DEC2在基因及蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)。而HSC-3細(xì)胞經(jīng)10μM濃度的CDDP處理后cleaved-PARP和BimEL的活性輕度增強(qiáng),且20μM及50μM濃度的CDDP顯著增強(qiáng)了二者的活性;同時(shí),經(jīng)CDDP處理后,DEC1的表達(dá)水平降

18、低,而DEC2的表達(dá)水平卻明顯升高。
　　 6、HSC-3細(xì)胞中,DEC2抑制CDDP誘導(dǎo)的Bim表達(dá)及細(xì)胞凋亡
　　 在CA9-22細(xì)胞中,DEC2過表達(dá)時(shí),無論CDDP存在與否,其對cleaved-PARP、caspase-3、caspase-8和Bim(EL,L,S)均沒有明顯影響。相反,在HSC-3細(xì)胞系中,當(dāng)DEC2過表達(dá)合并CDDP(20或50mM)作用時(shí),cleaved-PARP、caspase-3、cas

19、pase-8和Bim(EL,L,S)的活性均明顯降低。另外,DEC2的過表達(dá)并不影響B(tài)id和Bax的表達(dá)。同時(shí),在上述兩種細(xì)胞系中,DEC1的過表達(dá)無論是否合并CDDP處理,其對凋亡相關(guān)蛋白均無明顯影響。
　　 7、CDDP對細(xì)胞核/漿中DEC的影響
　　 采用間接免疫熒光染色法檢測了CDDP是否影響細(xì)胞核及細(xì)胞漿中DEC1和DEC2的表達(dá)水平。在CA9-22和HSC-3細(xì)胞中,CDDP對細(xì)胞核及細(xì)胞漿中DEC1的表達(dá)量

20、沒有明顯影響,而其對HSC-3細(xì)胞系中DEC2的表達(dá)卻產(chǎn)生具有顯著差異的影響。CDDPS對CA9-22細(xì)胞中DEC2在細(xì)胞核/漿中的表達(dá)影響也不大。
　　 8、DEC2過表達(dá)可抑制HSC-3細(xì)胞發(fā)生凋亡
　　 在CA9-22細(xì)胞中,DEC2的過表達(dá)合并CDDP處理對細(xì)胞活性幾乎沒有影響,相反,與對照組細(xì)胞活性相比,兩者的聯(lián)合作用卻明顯增加了HSC-3細(xì)胞的活性。在CDDP缺失的條件下,DEC2過表達(dá)對細(xì)胞活性的影響也很小

21、。
　　 結(jié)論
　　 1、抗癌藥物紫杉醇誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡過程中,DEC1和DEC2發(fā)揮相反的調(diào)節(jié)作用。
　　 在p53野生型細(xì)胞系MCF-7中,DEC1通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用;DEC2則通過直接或間接抑制半胱氨酸激酶(caspase-8)的活性而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。
　　 2、在抗癌藥物順鉑誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞HSC-3凋亡的過程中,DEC2發(fā)揮

22、抑制細(xì)胞凋亡的作用。
　　 順鉑誘導(dǎo)CA9-22細(xì)胞凋亡的同時(shí),抑制了DEC1和DEC2表達(dá)水平,且DEC1和DEC2的過表達(dá)對細(xì)胞凋亡過程沒有明顯影響。而在HSC-3中,順鉑抑制了DEC1的表達(dá),卻增加了DEC2的表達(dá);DEC1過表達(dá)對細(xì)胞凋亡過程沒有影響,而DEC2過表達(dá)明顯抑制了細(xì)胞凋亡過程,而這一作用主要通過抑制促凋亡蛋白Bim的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。
　　 3、DEC在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用,這可能與細(xì)胞系之間