三七總皂苷對(duì)B16細(xì)胞縫隙連接功能的影響及其對(duì)B16黑色素瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用.pdf

1、研究目的：觀察三七總皂苷(panax notoginseng saponins, PNS)對(duì)B16黑色素瘤轉(zhuǎn)移的作用。同時(shí)進(jìn)一步探明這種作用與其影響 B16細(xì)胞縫隙連接細(xì)胞間通訊(gap junction intercellular communication, GJIC)及縫隙連接蛋白32（Connexin32，Cx32）表達(dá)的關(guān)系和內(nèi)在機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：1.建立B16黑色素瘤自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型 C57BL/6小鼠60只，于小

2、鼠左后肢爪墊皮下注射 B16黑色素瘤細(xì)胞懸液50ul（1×107·ml-1）。建立模型24小時(shí)后，隨機(jī)分成生理鹽水組（NS，0.2 mL·10g-1），PNS（120mg·kg-1）、PNS（240mg·kg-1）、PNS（480mg·kg-1）三個(gè)劑量組，每組12只。每日灌胃給藥，給藥體積為0.2 mL·10g-1。（1）接種瘤液后第23天，用0.5％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，結(jié)扎股動(dòng)脈，截除荷瘤下肢，稱重，計(jì)算抑瘤率。（2）切除原發(fā)灶后繼

3、續(xù)給藥三周，于模型建立后第46天處死小鼠，取下小鼠肺臟，觀察肺臟腫瘤轉(zhuǎn)移情況，對(duì)肺轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行計(jì)數(shù)。（3）免疫組化檢測(cè)Cx32在黑色素瘤原發(fā)灶的表達(dá)情況，觀察PNS對(duì)黑色素瘤原發(fā)灶中Cx32表達(dá)的影響。2.采用劃痕標(biāo)記/染料示蹤技術(shù)（SL/DT），觀察不同濃度 PNS作用 B16細(xì)胞，其 GJIC功能的變化。用分子量為457.2D的熒光黃染料(Lucifer Yellow, LY)標(biāo)記損傷細(xì)胞，通過(guò)LY染料在細(xì)胞間的傳遞情況來(lái)反映細(xì)胞間的

4、縫隙連接通訊功能。3.免疫印跡（Western blot）檢測(cè)Cx32在各組B16細(xì)胞中的表達(dá)情況。4.通過(guò)細(xì)胞-基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)，觀察PNS對(duì)B16細(xì)胞與基質(zhì)膠（Matrigel）的粘附能力的影響
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.成功建立B16黑色素瘤自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型小鼠于接種腫瘤細(xì)胞后8~12天在接種部位形成黑素沉著斑，之后逐漸增大，突起，形成腫瘤結(jié)節(jié)。于接種瘤液后第23天切除腫瘤，見(jiàn)腫瘤質(zhì)地較軟，黑色，包膜基本完整部分有壞死或潰瘍。HE染色病

5、理組織學(xué)檢查：瘤組織排列結(jié)構(gòu)復(fù)雜，呈巢狀、或彌散分布。細(xì)胞體積大，多邊形，核呈空泡狀，核仁明顯，部分可見(jiàn)核分裂像，腫瘤細(xì)胞內(nèi)含有黑色素顆粒，提示B16-BL6小鼠黑色素瘤自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型復(fù)制成功。2. PNS對(duì)原發(fā)位黑色素瘤生長(zhǎng)的影響 PNS（240mg·kg-1、480mg·kg-1）兩個(gè)劑量組，與對(duì)照組瘤重相比較具有顯著性差異，腫瘤抑制率分別達(dá)到32.09%和50.85%。3. PNS對(duì)黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的影響通過(guò)對(duì)小鼠肺轉(zhuǎn)移灶計(jì)數(shù)和評(píng)分

6、結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，與模型組相比PNS240mg·kg-1、480mg·kg-1兩個(gè)劑量組能有效抑制黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和大小與對(duì)照組相比有明顯地減少和縮小。4. PNS對(duì)黑色素瘤細(xì)胞膜上Cx32的表達(dá)的影響免疫組織化學(xué)檢測(cè)并對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行分級(jí)，經(jīng)分析后得到的結(jié)果顯示：PNS各用藥組中的黑色素瘤原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞膜上Cx32的表達(dá)均得到了增強(qiáng)。5. PNS對(duì)B16細(xì)胞的縫隙連接通訊功能的作用采用劃痕標(biāo)記/染料示蹤技術(shù)（SL/DT

7、）在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)不同劑量的PNS（100μg·ml-1、200μg·ml-1、400μg·ml-1）在不同程度上提高了B16細(xì)胞間的GJIC功能。隨PNS濃度增高，LY染料傳輸范圍逐漸增大，最遠(yuǎn)可達(dá)劃痕旁3～4層細(xì)胞。6. PNS對(duì)B16細(xì)胞中Cx32的表達(dá)量的影響 Western blot的檢測(cè)結(jié)果顯示PNS各劑量組與對(duì)照組比較Cx32的表達(dá)量無(wú)明顯變化。7. PNS對(duì)B16細(xì)胞與基質(zhì)的粘附能力的影響通過(guò)細(xì)胞-基質(zhì)粘附實(shí)

8、驗(yàn)結(jié)果計(jì)算腫瘤細(xì)胞的相對(duì)粘附率，結(jié)果顯示PNS能夠抑制 B16細(xì)胞的基質(zhì)粘附能力。同時(shí)發(fā)現(xiàn)GJ功能增強(qiáng)劑維甲酸鈉（all trans-retinoic acid,RA）同樣具有抑制 B16細(xì)胞與基質(zhì)粘附能力的作用，表明GJ功能的上調(diào)和恢復(fù)能夠影響腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)粘附能力。PNS對(duì)B16細(xì)胞的基質(zhì)粘附能力的抑制作用可能與其上調(diào)腫瘤細(xì)胞間的GJ功能有關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1. PNS能夠抑制B16黑色素瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。