雷公藤內(nèi)酯醇和美托洛爾對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株的影響.pdf

1、目的：黑色素瘤惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移且手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率高。目前，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)不斷地增加?，F(xiàn)在的醫(yī)療手段對其并沒有理想的治療方法。為尋找治療惡性黑色素瘤的有效藥物，本文探討雷公藤內(nèi)酯醇和美托洛爾對小鼠黑色素瘤 B16細(xì)胞株的影響及部分作用機(jī)制，為臨床治療提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　2、采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法繪制B16細(xì)胞的生長曲線，了解B16細(xì)胞生長特征，為后續(xù)試驗做準(zhǔn)備。<

2、br>　　3、采用MTT法檢測兩種藥物在不同時間和不同濃度下對B16細(xì)胞的影響。
　　4、應(yīng)用倒置顯微鏡和HE染色法觀察B16細(xì)胞在藥物干預(yù)前后相關(guān)因素的變化。
　　5、應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測B16細(xì)胞周期和凋亡情況。
　　6、采用免疫細(xì)胞技術(shù)檢測血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)情況。
　　7、應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1、MTT法繪制B16細(xì)胞生長曲線
　　細(xì)胞

3、在96孔板中培養(yǎng)不同時間后，用酶標(biāo)儀測OD值，繪制成的生長曲線近似“S”型。
　　2、 MTT檢測結(jié)果
　　隨著雷公藤內(nèi)酯醇濃度的增高、藥物作用時間的延長，其對細(xì)胞的抑制作用越大（P<0.05）。隨著美托洛爾濃度的增高、藥物作用時間延長，其對細(xì)胞的抑制作用越大（P<0.05）。雷公藤內(nèi)酯醇組與美托洛爾組比較，兩種藥物干預(yù)細(xì)胞24小時后，2.5ng/ml濃度的雷公藤內(nèi)酯醇組的抑制率與15.63ug/ml濃度的美托洛爾組的抑制率

4、無顯著差異（P>0.05）；5.0ng/ml濃度的雷公藤內(nèi)酯醇組的抑制率與31.25ug/ml濃度的美托洛爾組的抑制率無顯著差異（P>0.05），其余不同濃度組間相比有顯著差異（P<0.05）。兩種藥物干預(yù)細(xì)胞48小時后，2.5ng/ml濃度的雷公藤內(nèi)酯醇組的抑制率與15.63ug/ml濃度的美托洛爾組的抑制率無顯著差異（P>0.05）；5.0ng/ml濃度的雷公藤內(nèi)酯醇組的抑制率與31.25ug/ml濃度的美托洛爾組的抑制率無顯著差異

5、（P>0.05），其余不同濃度組間相比有顯著差異（P<0.05）。兩種藥物干預(yù)細(xì)胞72小時后，兩藥物不同濃度組間相比較均有顯著差異（P<0.05），且25ng/ml濃度的雷公藤內(nèi)酯醇組對B16細(xì)胞抑制作用最大。
　　3、倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)特征及培養(yǎng)基顏色觀察
　　藥物干預(yù)前，B16細(xì)胞生長良好，呈多角形或菱形，貼壁生長，單層均勻分布，細(xì)胞間可見細(xì)絲連接，細(xì)胞膜完整，可見細(xì)胞核，折光性好，培養(yǎng)基澄清透明。藥物干預(yù)后，細(xì)胞貼壁

6、能力下降，部分細(xì)胞呈漂浮生長狀態(tài)，細(xì)胞變小、變圓、皺縮，細(xì)胞間連接消失，核折光性下降，隨著藥物濃度的增高及藥物作用時間的延長，細(xì)胞的形態(tài)變化越大,且雷公藤內(nèi)酯醇組對細(xì)胞形態(tài)影響強(qiáng)于美托洛爾組。雷公藤內(nèi)酯醇組培養(yǎng)基的顏色隨著藥物濃度的變大、作用時間的延長，各濃度組間呈現(xiàn)由暗黃色到粉紅色的梯度顏色變化。美托洛爾各濃度組間培養(yǎng)基顏色無明顯變化。
　　4、HE染色觀察B16細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征
　　藥物干預(yù)前，鏡下可見細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色，細(xì)胞

7、核呈藍(lán)色，可見核分裂，多個細(xì)胞核，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞貼壁數(shù)目較多，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞分布均勻。藥物干預(yù)后，貼壁細(xì)胞數(shù)目少，細(xì)胞間連接消失，可見孤立、成團(tuán)的細(xì)胞，細(xì)胞膜部分破裂，可見細(xì)胞核萎縮、碎裂。比倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)更清晰。相對于美托洛爾組而言，雷公藤內(nèi)酯醇對細(xì)胞形態(tài)影響更大。
　　5、藥物對B16細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡的影響
　　兩藥物組分別與對照組比較，G0/G1期隨著藥物濃度增高，處于該周期的細(xì)胞比例增加（P<0

8、.05），S期隨著藥物濃度的增高，處于該期的細(xì)胞比例減少（P<0.05）。兩種藥物干預(yù)細(xì)胞48小時后，在B16細(xì)胞 DNA直方圖上沒有發(fā)現(xiàn)明顯的亞 G1峰（細(xì)胞凋亡峰）。
　　6、藥物對B16細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)影響
　　兩種藥物組分別與對照組比較，VEGF蛋白量表達(dá)均下降（P<0.05），且雷公藤內(nèi)酯醇組隨著藥物濃度的增加VEGF表達(dá)量下降（P<0.05），美托洛爾組隨著藥物濃度的增加VEGF表達(dá)量無明顯下降（P>0.05

9、）。雷公藤內(nèi)酯醇組與美托洛爾組比較，雷公藤內(nèi)酯醇使 VEGF蛋白表達(dá)量的下降更顯著。
　　結(jié)論：
　　1、雷公藤內(nèi)酯醇和美托洛爾均可抑制小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖，且在一定范圍內(nèi)具有濃度依賴性和時間依賴性。
　　2、雷公藤內(nèi)酯醇和美托洛爾可將細(xì)胞周期抑制在 G0/G1期，且在一定范圍內(nèi)有濃度依賴性。本實驗未檢測到兩種藥物引起的凋亡現(xiàn)象，可能是被干預(yù)的細(xì)胞正處于凋亡的早期階段等原因，故不能排除兩種藥物通過凋亡機(jī)制抑制B