伊曲康唑和薏苡仁油對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株的影響.pdf

1、目的：黑色素瘤為皮膚及黏膜常見的侵襲性腫瘤，在過去的幾十年間，其發(fā)病率和死亡率在逐年上升，如何能更好的控制其病情的發(fā)展和延長患者生存期，已經(jīng)成為臨床醫(yī)生面臨的主要問題。
　　伊曲康唑?yàn)榕R床常用的一線三唑類抗真菌藥物，廣泛應(yīng)用于各種淺部和深部真菌感染，伊曲康唑注射液還應(yīng)用于系統(tǒng)性真菌感染。近年來W shi等學(xué)者發(fā)現(xiàn)，伊曲康唑具有抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用[1],Inoue K等通過研究發(fā)現(xiàn)伊曲康唑顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和遷

2、移[2]。Lockhart NR發(fā)現(xiàn)在用伊曲康唑治療一位胰腺癌晚期患者合并的真菌感染時(shí)，原本失去手術(shù)機(jī)會(huì)的這位患者在接受了9個(gè)月的治療后，病情得到控制，腫瘤縮小，重新獲得了手術(shù)切除腫瘤的機(jī)會(huì)。在whipple手術(shù)后幾年時(shí)間隨訪中未發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。伊曲康唑的這種抗腫瘤作用已經(jīng)為越來越多的醫(yī)務(wù)工作者所認(rèn)識(shí)。
　　薏苡仁油為禾本科植物薏苡種仁中提取的一種活性物質(zhì)，其主要活性成份為脂肪酸及脂類，其中抗腫瘤成份為甘油三酯類。PPei等

3、發(fā)現(xiàn)薏苡仁油（康萊特）在lewis肺癌的治療過程中表現(xiàn)出強(qiáng)有力的抗腫瘤及免疫刺激活性[4]。Lu X等學(xué)者報(bào)道通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)薏苡仁提取物對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，且可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡[5]。本文將通過實(shí)驗(yàn)觀察伊曲康唑及薏苡仁油對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株的影響及部分作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　2.四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法繪制小鼠B16細(xì)胞的生長曲線，完成對(duì)其生長特征觀察。<

4、br>　　3.運(yùn)用MTT法檢測(cè)兩種藥物在不同濃度及作用時(shí)間下對(duì)小鼠B16細(xì)胞的影響。
　　4.倒置顯微鏡下和HE染色法觀察B16細(xì)胞在藥物作用前后細(xì)胞形態(tài)變化。
　　5.運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測(cè)藥物干預(yù)后B16細(xì)胞周期變化及凋亡情況。
　　6.運(yùn)用細(xì)胞免疫組化技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）表達(dá)情況。
　　7.應(yīng)用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.MTT法繪制B1

5、6細(xì)胞生長曲細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)不同時(shí)間后，用酶標(biāo)儀測(cè)OD值，繪制成的生長曲線近“S”型。
　　2.MTT法檢測(cè)藥物干預(yù)作用結(jié)果
　　MTT結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，伊曲康唑組隨藥物濃度增大，作用時(shí)間的延長，對(duì)B16細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)（P<0.05）。薏苡仁油組隨藥物濃度增大，作用時(shí)間的延長，對(duì)B16細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)（P<0.05）。兩實(shí)驗(yàn)組比較，兩藥物作用24小時(shí)后，1.41μg/ml的伊曲康唑與20μl/ml的薏苡仁油，2

6、.82μg/ml的伊曲康唑與40μl/ml的薏苡仁油，5.65μg/ml的伊曲康唑與80μl/ml的薏苡仁油，11.30μg/ml的伊曲康唑與160μl/ml的薏苡仁油抑制率比較后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩藥物作用48小時(shí)后，1.41μg/ml的伊曲康唑與20μl/ml的薏苡仁油抑制率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其余組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。兩藥物作用72小時(shí)后，各濃度伊曲康唑與薏苡仁油組間比較差異均有統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)差異（P<0.05），其中濃度為11.30μg/ml的伊曲康唑?qū)π∈驜16細(xì)胞的抑制作用最大。
　　3.倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)特征和培養(yǎng)基顏色觀察
　　肉眼觀察培基顏色變化：伊曲康唑組隨著作用時(shí)間的延長，培基顏色由最初的淡黃逐漸變化為深紅色，且濃度越大作用時(shí)間越長，顏色深度變化程度越明顯。薏苡仁油組培基顏色變化不太明顯。倒置顯微鏡下形態(tài)變化：對(duì)照組B16細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞呈多角形或菱形，細(xì)胞連接緊密，貼壁均勻生長，胞膜

8、完整，胞漿透亮，可見胞核。藥物作用后，鏡下可見細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞變圓，體積變小，偽足減少甚至消失，細(xì)胞變得皺縮漂浮，可見細(xì)胞碎屑，部分成團(tuán)，胞漿不均勻。相對(duì)于薏苡仁油組，伊曲康唑組的變化更為明顯。
　　4.HE染色觀察B16細(xì)胞形態(tài)學(xué)特細(xì)胞經(jīng)HE染色，胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)染色均勻呈粉紅色，部分細(xì)胞可見多核及核分裂像，胞膜完整，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞間連接緊密。藥物干預(yù)后細(xì)胞貼壁數(shù)目減少，形態(tài)變圓，體積縮小，部分脫落，胞質(zhì)濃縮邊緣化，與倒置顯微

9、鏡下直接觀察相比，染色后細(xì)胞形態(tài)變化更加直觀、清晰。兩實(shí)驗(yàn)組比較，伊曲康唑組較薏苡仁油組對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響更為顯著。
　　5.藥物對(duì)B16細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡的影響
　　藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響：兩種藥物與對(duì)照組對(duì)比可發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增高，G0/G1期的細(xì)胞比例逐漸增加，S期比例逐漸減小且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響：藥物作用24小時(shí)后，DNA直方圖并未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡峰。
　　6.

10、藥物對(duì)B16細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)影響免疫組化法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，兩種藥物作用后VEGF蛋白量表達(dá)均下降（P<0.05）伊曲康唑組：隨著藥物濃度的增加VEGF表達(dá)量下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。薏苡仁油組：隨著藥物濃度的增加VEGF表達(dá)量下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩實(shí)驗(yàn)組比較，伊曲康唑組VEGF蛋白表達(dá)量下降更為明顯。
　　結(jié)論：
　　1.伊曲康唑和薏苡仁油均對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增

11、殖有一定的抑制作用，在一定范圍內(nèi)，抑制作用隨藥物濃度加大及作用時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)。
　　2.伊曲康唑和薏苡仁油均對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)有抑制作用并呈濃度依賴，且伊曲康唑的抑制作用強(qiáng)于薏苡仁油。由此可見，抑制VEGF蛋白表達(dá)可能是兩種藥物抗B16細(xì)胞增殖的原因之一。
　　3.伊曲康唑和薏苡仁油均可以將小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。本實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到明顯凋亡峰，可能原因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生處