紫檀芪通過抑制JAK2-ST AT3信號通路抗人骨肉瘤細(xì)胞活性研究.pdf

1、研究背景：
　　骨肉瘤是一種兒童及青少年最常見的惡性骨腫瘤,高發(fā)于四肢長骨的干骺端。目前常規(guī)的化療藥物均為細(xì)胞毒性藥物,副作用大。幾乎一半的兒童期腫瘤幸存者因為抗腫瘤治療至少承受一個不良后果。化療藥物早期毒性包括血液系統(tǒng)毒性,急性肝臟毒性和腎毒性。生存期的延長導(dǎo)致了晚期化療毒性的增加。主要的晚期毒性有:心臟毒性、繼發(fā)腫瘤、不育、慢性腎衰竭和神經(jīng)系統(tǒng)毒性。因此尋找低毒的抗骨肉瘤藥物具有重要的臨床意義。
　　紫檀芪(PTE)是一

2、種來源于我們食物的天然化合物,毒性極低,對人體是安全的。PTE是白藜蘆醇的二甲基化類似物,具有多種生物學(xué)活性,可以抗炎、抗氧化、抗增殖、抗腫瘤及止痛。因甲氧基團(tuán)替代了羥基增加了親脂性,增加了生物利用度,從而增加了活性。研究表明PTE可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡,包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌及白血病等。PTE是否具有抗骨肉瘤作用目前尚無人研究。
　　PTE抗腫瘤作用涉及多種細(xì)胞分子和信號通路,如單磷酸腺苷活化激酶(A

3、MPK)、細(xì)胞基質(zhì)鈣超載、活性氧(ROS)、自噬、Wnt信號通路及溶酶體膜通透作用增強(qiáng)等,但具體的抗腫瘤機(jī)制目前尚不清楚。JAK/STAT通路對體內(nèi)多種信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)都非常的關(guān)鍵,對多種哺乳動物發(fā)育及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定都異常的重要。JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3及酪氨酸激酶2,這4個蛋白結(jié)構(gòu)及功能相似。JAK的活化在細(xì)胞增殖、分化、遷移及凋亡中均有重要的作用。結(jié)構(gòu)活化的JAKs會使細(xì)胞內(nèi)許多重要的物質(zhì)磷酸化,其中包括STAT家族,ST

4、AT家族中的STAT3與許多腫瘤的信號通路相關(guān)。結(jié)構(gòu)活化后的STAT3和人實體腫瘤細(xì)胞的存活與生長關(guān)系密切。STAT3還可上調(diào)人腫瘤細(xì)胞抗凋亡基因編碼的Mcl-1、Bcl-xL蛋白。PTE可以抑制STST3的磷酸化,磷酸化的STST3是一種腫瘤快速生長的標(biāo)志。更為重要的是活化的JAK2/STAT3信號作為治療實體腫瘤一個重要的目標(biāo)分子已經(jīng)被廣泛的確認(rèn)其有效性。PTE抗骨肉瘤的作用是否與抑制JAK2/STAT3通路的磷酸化程度有關(guān)目前尚不

5、清楚。
　　第一部分：PTE抗人骨肉瘤細(xì)胞活性研究
　　研究目的：
　　研究PTE對人骨肉瘤細(xì)胞生長及凋亡的影響;研究PTE對人骨肉瘤細(xì)胞遷移及粘附能力的影響。
　　研究方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及處理
　　人骨肉瘤細(xì)胞系SOSP-9607(9607),復(fù)蘇后在10％的胎牛血清DMEM液中培養(yǎng),加入L-谷酰胺、青霉素、鏈霉素及HEPES液。孵箱內(nèi)溫度維持在37°C,CO2濃度為5%。收集細(xì)胞備用。

6、>　　PTE原液中加入二甲基亞砜,以培養(yǎng)液稀釋,即配即用。對照組中加入0.01%的二甲基亞砜。實驗組加入PTE,濃度梯度為1、2及4μM。
　　2.細(xì)胞活力檢測
　　細(xì)胞預(yù)處理后以PBS液洗滌三次,加入MTT液,37°C的孵箱中孵育4h,加入二甲基甲酰胺,震蕩,在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上檢測細(xì)胞活力。細(xì)胞活力以各孔吸光值(OD)的形式記錄,測定各孔光吸收值,記錄結(jié)果,繪制細(xì)胞生長曲線。并在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、照相。

7、　　3.細(xì)胞周期分析
　　細(xì)胞預(yù)處理后胰酶消化,70%的乙醇固定后PBS液洗滌,加入核糖核苷酸及碘化丙啶,避光室溫下孵育30min。以配備數(shù)據(jù)采集及分析系統(tǒng)的流式細(xì)胞儀分析并記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果以熒光密度分布圖的形式表示,熒光密度代表細(xì)胞數(shù)目。
　　4.線粒體跨膜電位(MMP)分析
　　將細(xì)胞放入六孔板中加入不同濃度的PTE,孵育24h。以PBS液洗滌,加入JC-1工作液,避光37°C孵育。細(xì)胞洗滌后懸浮于PBS液中,將染色

8、的細(xì)胞用上述流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果以較低MMP的細(xì)胞比例表示。
　　5.細(xì)胞凋亡分析
　　將細(xì)胞預(yù)處理后,冰PBS液沖洗,加入熒光標(biāo)記的共軛膜聯(lián)蛋白及碘化丙啶,使用上述流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況并用相關(guān)軟件進(jìn)行分析。碘化丙啶陰性且共軛膜聯(lián)蛋白陽性的細(xì)胞被認(rèn)為是早期凋亡細(xì)胞,雙陰性細(xì)胞被認(rèn)為是正常細(xì)胞。
　　6.劃痕試驗
　　培養(yǎng)細(xì)胞至鋪滿瓶底后,微量管尖端在單層細(xì)胞處制造劃痕。將分離的細(xì)胞以PBS洗滌干凈,加入PT

9、E24h后,使用顯微鏡觀察并記錄劃痕邊緣距離變化情況。結(jié)果以每組劃痕之間的距離數(shù)值表示。
　　7.細(xì)胞粘附實驗
　　PTE處理骨肉瘤細(xì)胞24h后消化、離心,懸浮在加入10%胎牛血清的DMEM液中。37°C下孵育30min,PBS液洗滌。將貼壁細(xì)胞用法MTT染色,在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞粘附情況并照相。加入二甲基甲酰胺,37°C下震蕩孵育15min,在490nm條件下使用分光光度計測量,結(jié)果以O(shè)D值表示,將對照組OD值設(shè)為1

10、00%。
　　8.統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有的樣本一式兩份,重復(fù)至少3次,數(shù)據(jù)已平均值±標(biāo)注差的形式表示。實驗組間比較使用SPSS12.0,采用方差分析的方法(ANOVA)。差異P<0.05被認(rèn)為統(tǒng)計學(xué)上有意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.PTE對骨肉瘤細(xì)胞生長及凋亡的影響
　　骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中加入1,2及4μM濃度梯度的PTE后,分別培養(yǎng)12、24及36h,細(xì)胞生長均出現(xiàn)抑制。PTE對骨肉瘤細(xì)胞的生長抑制作用呈

11、劑量和時間依賴。培養(yǎng)至24h時PTE的IC50(50%抑制濃度)約為1.81μM。與對照組比較,PTE導(dǎo)致細(xì)胞粘附率下降。加入1、2及4μMPTE后,與對照組相比較,凋亡指數(shù)分別增加16.75±3.91%、21.55±3.26%及35.87±4.23%(P<0.01)。我們發(fā)現(xiàn)凋亡指數(shù)呈劑量依賴性。這個結(jié)果說明PTE對人骨肉瘤細(xì)胞有生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　2.PTE對骨肉瘤細(xì)胞遷移及粘附能力的影響
　　加入1、2及4

12、μM的PTE,孵育24h后,隨著濃度的增加,劃痕邊緣的距離顯著增加,分別增加至對照組的123.07±9.05%、161.53±8.28%及223.08±11.30%(P<0.01)。粘附細(xì)胞顯著減少,粘附率分別為對照組的62.29±9.43%、34.38±6.70%及13.64±3.35%(P<0.01)。這些結(jié)果表明PTE可以降低骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力及粘附能力。
　　3.PTE對骨肉瘤細(xì)胞MMP的影響
　　加入1、2及4μ

13、M的PTE,孵育24h后,低MMP細(xì)胞的比例顯著增加。各組低MMP的細(xì)胞比例分別增加至8.19±2.36%、16.17±2.68%及29.45±3.10%(與對照組比較,P<0.01)。結(jié)果表明PTE可以增加骨肉瘤細(xì)胞的MMP。
　　4.PTE對骨肉瘤細(xì)胞周期的影響
　　與對照組相比較,加入不同濃度的PTE后均會導(dǎo)致細(xì)胞G0-G1階段的聚積。G0-G1階段的細(xì)胞由對照組的33.27%增加至4μMPTE組的55.22%,可見P

14、TE會導(dǎo)致細(xì)胞周期G0-G1期的阻滯。
　　結(jié)論：
　　PTE具有很強(qiáng)的抗人骨肉瘤細(xì)胞活性的作用。PTE導(dǎo)致人骨肉瘤細(xì)胞G0-G1期阻滯,使細(xì)胞生長出現(xiàn)抑制;同時PTE降低了MMP,誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。PTE還可以減少骨肉瘤細(xì)胞的粘附能力及遷移能力。
　　第二部分：PTE抗人骨肉瘤細(xì)胞活性的機(jī)制研究
　　研究目的：
　　研究PTE抗人骨肉瘤細(xì)胞活性的相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及處

15、理
　　同第一部分最后一步實驗中加入AG490,PTE的濃度為4μM
　　2.細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)及谷胱甘肽水平(GSH)檢測
　　細(xì)胞預(yù)處理后胰酶裂解,加入DCFH-DA液,37oC下孵育2h。FLX800微量盤熒光光譜儀測量每孔二氯熒光素的強(qiáng)度。無細(xì)胞孔作為背景,將對照組熒光強(qiáng)度定為100%。
　　細(xì)胞加入培養(yǎng)皿中過夜后加入PTE24h后。PBS洗滌細(xì)胞。根據(jù)探針的操作指南,將細(xì)胞裂解后測量GSH的水平。在

16、測量前1h用2-乙烯基吡啶遮蔽GSH。GSH和GSSG的含量與正常標(biāo)準(zhǔn)的蛋白含量比較。結(jié)果以GSH的表達(dá)(%對照含量)或GSH/GSSG比例的形式表達(dá),使用還原形式的GSH或氧化形式的GSH(GSSG)作為標(biāo)準(zhǔn)。
　　3.Westen Blotting
　　將細(xì)胞樣本在樣本緩沖液中裂解,降噪處理,煮沸,跑凝膠,轉(zhuǎn)膜,封閉。加入p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、Mcl-1、CyclinD1、p21、p27、B

17、cl-xL、Bax、Bak及GAPDH的抗體4oC過夜。洗膜,加入對應(yīng)的二抗,室溫下放置90min,洗滌。使用BioRad成像系統(tǒng)觀察記錄熒光強(qiáng)度,并以ImageLab軟件定量分析。
　　4.細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的萃取
　　處理離心細(xì)胞,PBS液洗滌2次后懸浮于冰的細(xì)胞萃取緩沖液中,4oC下孵育40min,離心,上清液用來提取細(xì)胞色素C,加入5倍上清的緩沖液,100oC下煮沸7min,將蛋白溶液用Western blottin

18、g的方法測定細(xì)胞色素C的含量。
　　5.統(tǒng)計學(xué)分析
　　同第一部分。
　　研究結(jié)果：
　　1.PTE對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響
　　為了進(jìn)一步驗證細(xì)胞G0–G1阻滯,我們利用Western blotting的方法檢測周期蛋白D1、p21及p27的表達(dá)。與細(xì)胞周期阻滯一致,CyclinD1的表達(dá)水平降低,而p21和p27的表達(dá)水平升高。這個發(fā)現(xiàn)表明PTE可以導(dǎo)致細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。
　　2.PTE

19、對骨肉瘤細(xì)胞活性氧生成及谷胱甘肽水平的影響
　　加入1、2及4μM的PTE,孵育24h后骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧呈劑量依賴關(guān)系,分別增加至對照組的255.32±12.97%、411.59±16.24%及503.61±17.05%(與對照組比較,P<0.01)。
　　加入1、2及4μM的PTE,孵育24h后骨肉瘤細(xì)胞谷胱甘肽水平呈劑量依賴性降低,分別降低了80.51±3.06%、66.43±3.82%及52.30±3.49%。

20、(與對照組比較,P<0.01)。PTE會導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG的比例呈劑量依賴性降低。
　　3.對人骨肉瘤細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路及線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白的影響
　　加入PTE后磷酸化的JAK2及STAT3的表達(dá)水平降低。與磷酸化的JAK2及STAT3的表達(dá)下調(diào)相一致的是PTE使Mcl-1和Bcl-xL的表達(dá)水平也降低,且呈劑量依賴關(guān)系。除此之外PTE使線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白(Bax、Bak、細(xì)胞色素C)的

21、表達(dá)上調(diào)。
　　4.PTE聯(lián)合AG490對人骨肉瘤細(xì)胞活力及JAK2/STAT3信號的影響
　　聯(lián)合應(yīng)用PTE(4μM)和AG490(一種已知的JAK2/STAT3抑制劑,20μM)進(jìn)一步抑制了骨肉瘤細(xì)胞的活力(與單獨的PTE組或AG490組比較,P<0.01)。并且聯(lián)合應(yīng)用PTE和AG490也進(jìn)一步抑制了JAK2及STAT3的磷酸化程度。
　　結(jié)論：
　　PTE通過抑制JAK2/STAT3信號通路影響CDK/C