燙傷大鼠結(jié)腸Kit、Kitl及Gja1基因表達(dá)與胃腸動(dòng)力障礙的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、在嚴(yán)重燙傷患者，早期及后續(xù)病程中常伴有腹部脹氣、腸鳴音減弱或消失、腸麻痹等胃腸道運(yùn)動(dòng)障礙的表現(xiàn)。以往研究者多將這些癥狀歸因于：燙傷后應(yīng)激反應(yīng)性高血糖，及其所引起的下丘腦飽感中樞抑制；交感神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮；傷后血中兒茶酚胺濃度增高，使得腸肌緊張性減弱、運(yùn)動(dòng)受到抑制；腸管壁內(nèi)某些腦啡肽的釋放；低鉀血癥導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞膜超極化等[1]。而對(duì)于燙傷后是否伴有胃腸道平滑肌細(xì)胞的節(jié)律性電活動(dòng)(由其引發(fā)平滑肌的節(jié)律性舒縮運(yùn)動(dòng))的產(chǎn)生機(jī)制及其相關(guān)調(diào)控因子

2、的改變，尚少見研究報(bào)道。 Cajal間質(zhì)細(xì)胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)是一種廣泛分布于哺乳動(dòng)物胃腸道的特殊間質(zhì)細(xì)胞。除了作為起搏細(xì)胞，自發(fā)地產(chǎn)生并傳導(dǎo)節(jié)律性的去極化波(慢波)，從而引發(fā)胃腸平滑肌的規(guī)律性收縮外[2]，它還參與了植物神經(jīng)、腸神經(jīng)和某些胃腸激素對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)過程，并與胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生密切相關(guān)。已經(jīng)知道，一些伴有胃腸道動(dòng)力減退表現(xiàn)的疾病如：胃食管反流病、慢傳輸型便秘、糖尿

3、病性胃輕癱等，都不同程度的伴有Caial間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的損害，且其受損程度與胃腸道運(yùn)動(dòng)功能減退的輕重有關(guān)。而對(duì)于嚴(yán)重燙傷后腸道Caial間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)、功能、其影響調(diào)控因子的改變，以及與胃腸道動(dòng)力障礙之間關(guān)系的研究迄今還較少見到。 目的：通過測(cè)定7cm×4cm面積的Ⅲ度燙傷大鼠的腸道推進(jìn)速率，結(jié)腸組織中三種與Cajial間質(zhì)細(xì)胞的平滑肌電起搏活動(dòng)相關(guān)的蛋白基因-Kit(編碼ICC胞膜上具酪氨酸蛋白激酶活性的c-kit受

4、體)、Kitl(編碼c-kit的配體—干細(xì)胞因子SCF)及Gjal(慢波產(chǎn)生與傳導(dǎo)所必需的縫隙連接蛋白Cx43的編碼基因)相應(yīng)mRNA的表達(dá)水平，探討燙傷對(duì)大鼠結(jié)腸組織中上述三種基因表達(dá)的影響，以初步了解嚴(yán)重燙傷后腸道ICC功能上的變化，及其與胃腸道動(dòng)力障礙之間可能的聯(lián)系。 方法：56只健康成年Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為2組，燙傷補(bǔ)液組48只(以下簡(jiǎn)稱燙傷組)、正常對(duì)照組8只。各組大鼠分籠飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)開始前禁食1

5、2h，自由飲水。燙傷組大鼠腹腔注射1％戊巴比妥鈉麻醉后，背部剃毛并浸入97℃以上熱水中15s，造成7cm×4cm的Ⅲ度燙傷創(chuàng)面(方法參照《燒傷治療學(xué)》)。傷后即給予乳酸鈉林格液腹腔注射行液體復(fù)蘇(50ml/kg)；對(duì)照組未做特殊處理。燙傷組大鼠分別于傷后3h、6h、9h、16h、24h、48h(正常對(duì)照組于禁食12h后)無痛斷頸處死。立即剪取上段結(jié)腸組織各約100mg，裝入EP管置液氮生物容器保存；大鼠處死前30min并行碳素墨水灌胃(

6、1ml/只)。處死后即快速小心分離出胃至結(jié)腸上段全長(zhǎng)，無張力狀態(tài)下平鋪于桌面白紙上，直尺測(cè)量其墨水推進(jìn)最遠(yuǎn)端距離幽門的長(zhǎng)度，并用以表示大鼠腸道推進(jìn)速率。所獲大鼠結(jié)腸樣本經(jīng)低溫下研磨，TRIzol R、氯仿等提取總RNA，并由逆轉(zhuǎn)錄過程獲得相應(yīng)cDNA后，部分轉(zhuǎn)移至含有Kit、Kitl等基因的相應(yīng)引物及dNTP、SYBR R GREEN Ⅰ試劑的新反應(yīng)體系，行多聚酶鏈反應(yīng)—實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time quantitaftve

7、PCR)。最后將部分PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入瓊脂糖凝膠，電泳、鑒定。 結(jié)果： ①腸道推進(jìn)速率：傷后3h、6h、9h、16h、24h、48h燙傷組均明顯低于正常對(duì)照組水平，差異學(xué)意義(p＜0.05)。 ②2-△△Ct值(熒光定量PCR)：傷后3h、6h、9h、16h、24h、48h，燙傷組Gja1、Kit1對(duì)應(yīng)的2-△△Ct值明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。燙傷組Kit 2-△△Ct值則于傷后6h、

8、9h、16h、24h、48h明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；傷后3h雖有降低，但與對(duì)照組間差異不顯著(p＞0.05)。 結(jié)論：燙傷后3h、6h、9h、16h、24h、48h，在大鼠胃腸道運(yùn)動(dòng)功能明顯抑制的同時(shí)，結(jié)腸組織中編碼胞間縫隙連接蛋白的Gial基因以及干細(xì)胞因子SCF的編碼基因Kit1表達(dá)明顯減弱；而與Cajal間質(zhì)細(xì)胞功能密切相關(guān)的c-kit蛋白編碼基因Kit表達(dá)則于傷后6h、9h、16h、24h、48

9、h明顯低于對(duì)照組；三者的水平在傷后48h后均有不同程度回升，但與對(duì)照組比較仍有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。上述指標(biāo)的變化大體與大鼠胃腸道運(yùn)動(dòng)速率的變化趨勢(shì)一致。鑒于Caja1間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生并傳導(dǎo)了絕大多數(shù)胃腸運(yùn)動(dòng)發(fā)生所必需的起搏電流，而Kit、Kit1、Gja1編碼的蛋白對(duì)于維持其起搏電位的產(chǎn)生、傳導(dǎo)以及頻率的正常至關(guān)重要，上述三種基因表達(dá)的改變(下降)會(huì)對(duì)機(jī)體的胃腸運(yùn)動(dòng)功能產(chǎn)生較明顯的影響。本次實(shí)驗(yàn)中測(cè)得燙傷大鼠結(jié)腸組織中三種基因