HBV-P22蛋白影響HepG2細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、研究背景： 我國是乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)感染的高流行區(qū)，一般人群的乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitisBvirussurfaceantigen，HBsAg)陽性率為9.09％，隨著HBV疫苗納入計劃免疫，一些大城市HBV感染率已有所降低，但HBV感染仍然是影響人類健康的重大公共問題之一。 HBV感染與肝細胞凋亡關系密切，CanbayA等認為在慢性HBV感染中，病毒為保持持續(xù)感染，宿主則

2、為清除病毒而進行雙方的較量，就病毒而言，在其增殖階段，抑制肝細胞凋亡，可使其在細胞內持續(xù)感染，大量繁殖；就宿主而言，細胞凋亡是限制病毒復制的自然細胞反應。凋亡細胞迅速被吞噬而無毒性物質漏出時，不會發(fā)生炎癥反應。但在病理條件下凋亡細胞數(shù)過多，超過吞噬細胞吞噬能力，凋亡細胞自發(fā)性裂解而內容物釋放，將會導致炎癥反應及組織損傷。在實際研究中，HBV感染與肝細胞凋亡之間的關系相當復雜，多種因素參與了肝細胞凋亡的調節(jié)，其中包括HBV病毒蛋白，目前研

3、究較多的是HBx蛋白，對前C/C蛋白與肝細胞凋亡的關系研究較少。HBV全基因組前C/C區(qū)開放讀框編碼多種病毒蛋白，主要包括HBcAg(P21)、HBeAg(P17)、25kD(P25)蛋白、22kD(P22)蛋白等，其中HBV/P22蛋白是由P25蛋白在內質網上切割信號肽后生成，HBV/P22蛋白在細胞內組織蛋白酶作用下水解C-端肽段，形成17kD的HBeAg(P17)分泌到細胞外，但部分HBV/P22蛋白滯留于胞漿內。 長期以

4、來，人們認為HBV前C/C區(qū)蛋白對細胞沒有生物調控作用，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)C區(qū)基因編碼的核心抗原可以調控細胞內的基因表達。HBcAg能反式抑制IFN-β基因轉錄，從而抑制細胞內IFN蛋白的表達；它能反式抑制MXA基因啟動子活性，EMSA證明HBcAg與MXA基因啟動子有直接相互作用。在我們的前期實驗中，我們通過構建HBcAg表達載體并篩選HepG2細胞克隆株進行研究，結果表明HBcAg表現(xiàn)為抑制FasAb及IFNa誘導的HepG2細胞凋亡

5、效應。HBV/P22蛋白含有核心抗原的全部氨基酸序列，因此該蛋白也可能參與抑制細胞凋亡。 TNFa在體內主要存在于肝臟中，約占全身30％，TNFa是重癥肝炎發(fā)病的核心細胞因子之一，但體外研究表明，TNFa誘導肝細胞凋亡需要某些因素協(xié)同作用，即TNFa誘發(fā)細胞凋亡需要其他因素在轉錄水平進行阻遏。放線菌素D(Act-D)是一種RNA合成抑制劑，Act-D處理后肝癌細胞對TNFa的刺激變得敏感，從而導致凋亡。有報道HBV/P22蛋白的

6、AA23-73部分與Fas死亡結合蛋白(FADD)的死亡效應區(qū)(DED)有23.5％的同源性，F(xiàn)ADD是TNFa誘導細胞凋亡的重要通路蛋白，因此HBV/P22蛋白可能通過影響Fas-FasL介導的凋亡途徑，從而抑制TNFa誘導的細胞凋亡。本研究通過體內、體外試驗較為深入的研究HBV/P22蛋白對肝細胞凋亡的影響。 研究目的： 1、在體外實驗中研究HBV/P22蛋白影響Act-D、TNFa誘導的HepG2細胞凋亡。

7、 2、在體內實驗中研究HBV/P22蛋白影響Act-D、TNFa誘導的HepG2瘤體細胞凋亡。 研究方法： 1、鑒定HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細胞株穩(wěn)定表達HBV/P22蛋白：HepG2-pCDNA3.1+、HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細胞株分別以1×106/孔接種于六孔板，3天后收集上清，雅培試劑檢測HBeAg表達，HBeAg含量S/CO參考值<2.1為陰性。前述兩組細胞株分別取107

8、個細胞裂解，常規(guī)方法進行HBV/P22蛋白的Westernblot檢測。 2、HBV/P22蛋白影響HepG2細胞凋亡的體外研究：采用流式細胞術及原位末端標記技術(terminaldeoxynucleotidemediatednickendlabelingTUNEL)檢測HBV/P22蛋白影響Act-D、TNFa誘導的HepG2細胞凋亡。使用終濃度為333nMAct-D及100μg/LTNFa誘導HepG2-pCDNA3.1+H

9、BV/P22細胞凋亡，同時以HepG2-pCDNA3.1+細胞作為對照，刺激時間6h后，使用流式細胞術(FlowCytometry，F(xiàn)CM)，利用AnnexinV-FITC雙染色，檢測細胞凋亡率；同樣方法培養(yǎng)和誘導細胞凋亡后，丙酮固定，樣本通透性處理后，使用TUNEL技術檢測細胞凋亡率，DAB顯色液顯色，倒置顯微鏡下觀察。陽性細胞判斷標準：細胞核呈棕黃色染色為陽性，細胞核無棕黃色染色為陰性，隨機取5個視野，高倍鏡下(400×)觀察記數(shù)陽

10、性細胞百分率。 3、裸鼠動物模型的建立：BALB/c-nu/nu裸鼠16只，隨機分為2組。收集培養(yǎng)的HepG2-pCDNA3.1+和HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細胞，以5×107/0.1ml/site細胞懸液分別注射于裸鼠的頸背部皮下。瘤體積平均值為100mm3左右，利用.Act-D、TNFa誘導瘤細胞凋亡，連續(xù)用藥5天，每天一次。停藥后第2天，處死裸鼠，收集瘤體標本，瘤體組織石蠟包埋，組織切片制作及HE染色觀察

11、瘤體形態(tài)。 4、免疫組化檢測腫瘤組織HBV/P22蛋白表達：石蠟切片抗原修復后，按免疫組化常規(guī)步驟，用HBeAg單克隆抗體檢測HBV/P22蛋白表達。DAB顯色液顯色，倒置顯微鏡下觀察。陽性細胞判斷標準：細胞核呈棕黃色染色為陽性，細胞核無棕黃色染色為陰性。 5、TUNEL測定腫瘤組織細胞凋亡率：石蠟包埋的組織切片，按常規(guī)方法進行脫蠟、水合、樣本通透性處理后，按TUNEL試劑盒操作，DAB顯色液顯色，倒置顯微鏡下觀察。陽性

12、細胞判斷標準：細胞核呈棕黃色染色為陽性，細胞核無棕黃色染色為陰性，隨機取5個視野，高倍鏡下(400×)觀察記數(shù)陽性細胞百分率。 結果： 1、鑒定HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細胞株穩(wěn)定表達HBV/P22蛋白；雅培分析檢測示HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細胞培養(yǎng)上清HBeAg表達陽性，對照組為陰性：Westernblot檢測顯示HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細胞有HBV/P22蛋白

13、表達，對照組為陰性。 2、HBV/P22蛋白影響HepG2細胞凋亡的體外研究：流式細胞術檢測結果顯示實驗組細胞凋亡率(3.77±0.76)％顯著低于對照組(23.31±5.82)％，(t=5.771，P=0.004)；細胞TUNEL檢測結果顯示實驗組細胞凋亡率(7.20±1.25)％顯著低于對照組(15.28±1.48)％，(t=9.349，P=0.000)。 3、裸鼠動物模型的建立：在飼養(yǎng)及用藥過程中，HepG2-pC

14、DNA3.1+HBV/P22細胞組裸鼠死亡2只，HepG2-pCDNA3.1+細胞組裸鼠死亡3只，每組取5只進行檢測，HE染色觀察瘤體形態(tài)良好。 4、免疫組化檢測腫瘤組織HBV/P22蛋白的表達：結果顯示注射HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22細胞株的動物腫瘤組織有較好的HBV/P22蛋白表達，對照組為陰性。 5、人肝癌腫瘤組織細胞TUNEL測定：TUNEL檢測結果顯示接種HepG2-pCDNA3.1+HBV/P