沉默UBC9對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　檢測泛素結(jié)合酶9(ubiquitin conjugating enzymes9，UBC9)在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，并采用shRNA方法研究下調(diào)UBC9后的肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的改變及其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1、采用蛋白印跡（Western Blot）技術(shù)檢測人肝癌細(xì)胞株HepG2、LM3、MHCC97h、Huh7、SMMC-7721中UBC9的表達(dá)。
　　2、設(shè)計并合成針對UBC9的短發(fā)夾RNA（s

2、hort hairpin RNA，shRNA）質(zhì)粒，采用陽離子脂質(zhì)體技術(shù)進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。實驗設(shè)置正常肝癌細(xì)胞組、脂質(zhì)體組、空載質(zhì)粒( NC-shRNA)組以及目的質(zhì)粒（UBC9-shRNA）組。
　　3、采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative Real Time-PCR，qRT-PCR）和蛋白印跡（Western Blot）技術(shù)分別檢測各組細(xì)胞UBC9在轉(zhuǎn)染前后mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　4、采用CCK8法

3、檢測轉(zhuǎn)染前后肝癌細(xì)胞增殖能力的變化，通過Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后肝癌細(xì)胞凋亡的變化。
　　5、采用蛋白印跡（Western Blot）技術(shù)檢測各組細(xì)胞中Bcl-2以及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的改變。
　　結(jié)果：
　　1、在HepG2、LM3、MHCC97h、Huh7、SMMC-7721這5種肝癌細(xì)胞株中UBC9蛋白表達(dá)均呈陽性高表達(dá)，UBC9表達(dá)量最高的是MHCC97h、最低的

4、是LM3，HepG2、SMMC-7721、Huh7這3中細(xì)胞中UBC9表達(dá)量沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2、目的質(zhì)粒UBC9-shRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞24h及48h后，UBC9在mRNA水平（24h）以及蛋白水平（48h）相比較正常肝癌細(xì)胞組、脂質(zhì)體組及空載質(zhì)粒組均下降。
　　3、CCK8法顯示UBC9-shRNA組肝癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降，流式細(xì)胞儀顯示UBC9-shRNA組肝癌細(xì)胞的凋亡水平最高。
　　4、Western

5、 Blot技術(shù)顯示，相比較正常肝癌細(xì)胞組、脂質(zhì)體組及NC-shRNA組，UBC9-shRNA組中Bcl-2蛋白水平明顯下降，NF-κB p65蛋白水平下降。
　　結(jié)論：
　　1、在肝癌細(xì)胞中UBC9為陽性高表達(dá)，本實驗旨在研究肝癌細(xì)胞增殖與凋亡的變化，故選取HepG2肝癌細(xì)胞做后續(xù)實驗。
　　2、目的質(zhì)粒 UBC9-shRNA能夠下調(diào)肝癌細(xì)胞中UBC9的表達(dá)，下調(diào)UBC9后的肝癌細(xì)胞增殖能力下降，細(xì)胞的凋亡增加。