人AIF C末端截短體分子的基因克隆表達及對HeLa細胞促凋亡活性的研究.pdf

1、細胞凋亡（apoptosis）是細胞受到生理或病理刺激后發(fā)生的自發(fā)性死亡過程。AIF（Apoptosis Inducing Factor，凋亡誘導(dǎo)因子）是1996年發(fā)現(xiàn)的一種凋亡效應(yīng)分子。正常情況下，AIF蛋白定位于細胞線粒體膜間隙，當有凋亡信號刺激時，AIF分子從線粒體釋放到細胞漿，再通過其核定位信號轉(zhuǎn)位到細胞核中，直接引起染色體凝集和DNA的大片段（~50kb）斷裂，導(dǎo)致細胞凋亡。 AIF的促凋亡活性不受Bcl-2過表達的影

2、響，也不依賴于caspases的活性，在低等真核細胞凋亡、以及哺乳類胚胎發(fā)育過程中AIF也具有不可或缺的作用。與caspases等其他凋亡效應(yīng)分子相比，AIF可直接誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生而不受胞漿中其他凋亡抑制因子的抑制， AIF的這一優(yōu)勢對于它誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，具有特殊意義。 Susin等研究發(fā)現(xiàn)，人AIF前體蛋白為67kD，包括以下幾個結(jié)構(gòu)域：從氨基端起，（1）氨基端100 aa長度的線粒體定位信號（MLS）；（2）27aa的Sp

3、acer序列；（3）核定位信號（NLS）；（4）羧基端485aa的氧化還原酶功能域（129-613位氨基酸）。AIF前體分子在線粒體被切割后，形成成熟的AIF分子，它由三部分構(gòu)成：一個FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域（122-262aa和400-477aa），一個NADH結(jié)合結(jié)構(gòu)域（263-399aa）和一個C末端結(jié)構(gòu)域（478-610aa）。 本室于翠娟博士成功克隆了成熟型AIF分子（AIFΔ1-120），并且證實了其促凋亡活性。在此基礎(chǔ)上本

4、室的劉湘麗碩士對AIF分子進行進一步截短成功構(gòu)建了四種截短型AIF基因即：AIFΔ1-300(301-613aa)、AIFΔ1-352(353-613aa)、AIFΔ1-400(401-613aa) 、AIFΔ1-480(481-613aa)基因，并證實這些截短型AIF分子仍具有促凋亡活性，鑒于這些截短型AIF分子仍然存在分子量過大的特點，在實際應(yīng)用中可能存在困難，我們擬對AIF分子進行進一步截短，以期獲得不影響AIF分子促凋亡活性的人

5、AIF C末端截短體分子。 本研究在前期獲得的截短型AIFΔ1-480的基礎(chǔ)上用PCR方法構(gòu)建了人AIF C末端截短體分子AIFΔ1-500(501-613aa)和AIFΔ1-530(531-613aa)，將其作為實驗組基因；同時構(gòu)建了陰性對照基因AIF360-480，將人AIF C末端截短體基因及陰性對照基因克隆入真核表達載體pcDNA3中，經(jīng)DNA測序，證實獲得序列正確。將帶有成熟型AIF基因的質(zhì)粒、AIF C末端截短體基因

6、的質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細胞，通過間接免疫熒光證實C末端截短體分子在細胞中的表達。利用熒光顯微鏡可觀察到，人AIF C末端截短體分子表達于細胞漿中，與陰性對照組相比，實驗組AIF分子的表達引起HeLa細胞出現(xiàn)細胞膜出泡，細胞核不均一等凋亡形態(tài)學(xué)變化。 由于人AIF C末端截短體分子的分子量較小，用Western blot不易檢測到，所以我們將人AIF C末端截短體分子基因與陰性對照基因均克隆入帶有Flag

7、標簽的真核表達載體pFlag-CMV4中，瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，Western blot檢測其表達，用激光共聚焦檢測其細胞定位，證實這些C末端截短體分子定位于細胞漿中。將人AIF C末端截短體分子瞬時轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細胞，用間接免疫熒光、MTT法、Annexin V分析證實了實驗組AIF分子可誘導(dǎo)Cytc的釋放并可抑制HeLa細胞的增殖。 綜上所述，人AIF C末端截短體分子AIFΔ1-500 及AIFΔ1-530均具有促凋