PTD4-apoptin誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡及其對(duì)bak-bax、AIF基因的影響.pdf

1、目的：利用原核表達(dá)載體 pGEX-6p-1-PTD4-apoptin表達(dá) PTD4-apoptin，分離純化后驗(yàn)證PTD4-apoptin誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的作用；探討PTD4-apoptin對(duì)促凋亡基因bak/b ax、細(xì)胞色素c和Caspase-3及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）的影響，研究apoptin誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的部分機(jī)制。
　　方法：將原核表達(dá)載體 pGEX-6p-1-PTD4-apoptin轉(zhuǎn)化至 Ecoli.BL2

2、1（DE3）菌株中，通過 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，提取純化得到目的蛋白。將 PTD4-apoptin，加入 Hela細(xì)胞的培養(yǎng)基中作用后，觀察 Hela細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，驗(yàn)證 PTD4-apoptin的凋亡作用，并使用 CCK8試劑盒檢測其對(duì) Hela細(xì)胞的抑制效果。然后，采用RT-PCR、western-blot檢測 PTD4-apoptin作用后，Hela細(xì)胞中 bak/bax表達(dá)量、細(xì)胞色素c和Caspase-3在細(xì)胞質(zhì)中的含量，及 AIF

3、在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中的含量變化。利用環(huán)孢霉素 A，抑制 AIF從線粒體中釋放，檢測 PTD4-apoptin對(duì) Hela細(xì)胞抑制作用，驗(yàn)證 AIF對(duì) P TD4-apoptin誘導(dǎo) Hela細(xì)胞凋亡作用的影響。
　　結(jié)果：成功獲得可溶性的 PTD4-apoptin，能誘導(dǎo) Hela細(xì)胞產(chǎn)生凋亡作用，顯著抑制 Hela細(xì)胞的生長；PTD4-apoptin作用 Hela細(xì)胞后， bak/bax的 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量均顯著增高

4、，細(xì)胞色素c和 Caspase-3在細(xì)胞質(zhì)中的含量均顯著上升， AIF在細(xì)胞質(zhì)中的含量也顯著高于線粒體中的含量；當(dāng)抑制 AIF從線粒體向細(xì)胞質(zhì)中釋放時(shí)，PTD4-apoptin對(duì) Hela細(xì)胞生長的抑制作用下降。
　　結(jié)論：PTD4-apoptin具有誘導(dǎo) Hela細(xì)胞凋亡的活性；PTD4-apoptin可能通過上調(diào)bak/bax基因的表達(dá)，促使線粒體膜通透性改變，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素c和 Caspase-3含量增高，AIF從線粒體中