AIF-1基因的原核表達及細胞分布的初步研究.pdf

1、同種異體移植炎癥因子(allograft inflammatory factor-1，AIF-1)，又稱離子化Ca2+結合調節(jié)器(ionized calcium-binding adapter molecule1，Iba1)，最初克隆自大鼠發(fā)生慢性排斥反應的同種異體心臟移植物中。到目前為止，許多物種的AIF-1基因已被克隆，包括人、小鼠、鯉魚、海綿、盤鮑等。AIF-1在大鼠精細胞中高表達，在多種組織及血清中有低蛋白水平存在。AIF-1能

2、夠結合并交聯(lián)肌動蛋白，在巨噬細胞/小膠質細胞細胞骨架的重組中具有重要的作用。在動脈損傷和炎癥下的血管平滑肌細胞中，AIF-1可被誘導產生，并能促進其增殖和遷移。此外，子宮內膜異位病人的腹水及類風濕性關節(jié)炎患者的關節(jié)滑液中，AIF-1的表達上調。AIF-1的表達分布機制及與病理過程的相關性，需要進一步深入研究。
　　首先我們從毛冠鹿(Elaphodus cephalophus, tufted deer)睪丸cDNA文庫中克隆到AIF

3、-1基因。該cDNA具有5’和3’非編碼區(qū)，從第81個到第518個核苷酸為一開放閱讀框，編碼一個145 aa的AIF-1蛋白。根據cDNA序列設計引物，將基因克隆至大腸桿菌表達載體pET-28a(+)中誘導表達，并對重組蛋白進行純化。結果顯示，重組質粒經1 mmol/L IPTG誘導4h后，在約20kDa處有一明顯條帶與理論值大小相近，Western Blot檢測其可被抗AIF-1抗體識別，說明表達成功。超聲破碎后離心，重組蛋白主要存在

4、于上清液中，可用于制備抗體以進行后續(xù)實驗。
　　其次我們檢測了不同細胞系中AIF-1 mRNA和蛋白質水平的表達狀況。RT-PCR和Western Blot結果顯示，AIF-1在HL-60細胞系中高表達，在Jurkat細胞系中表達水平較低。設計引物，從HL-60細胞系中克隆人AIF-1 cDNA，構建真核表達載體pEGFP-C3-AIF-1，pEGFP-N1-AIF-1，通過EGFP示蹤AIF-1蛋白的細胞分布。轉染Hela、29