葉酸在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的防護(hù)作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是世界五大常見腫瘤之一，其死亡率在惡性腫瘤中居第三位。全球范圍內(nèi)肝癌的發(fā)生率和致死率居高不下，而在中國尤甚。盡管過去的幾十年里，臨床對(duì)肝癌的診斷和治療已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，但是還存在一定的局限性。由于肝癌的惡性程度高、預(yù)后差、五年生存率仍然很低，因此僅依靠治療并不能從根本上消除肝癌給人類帶來的威脅，在腫瘤預(yù)防已成為全球性趨勢(shì)的情況下，研究如何預(yù)防肝癌的發(fā)生成為當(dāng)前亟待解決的重要臨床問題。
　　 近年來的研究表明，DNA甲

2、基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙?；揎椀缺碛^遺傳學(xué)修飾對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控起著重要作用，上述表觀遺傳學(xué)修飾的紊亂在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用正日益引起人們的重視。而葉酸作為飲食中必需的營養(yǎng)成分，和上述表觀遺傳修飾之間有著復(fù)雜的相互作用，能夠通過影響表觀遺傳修飾來調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生顯著影響。近年來流行病學(xué)調(diào)查及動(dòng)物模型研究皆表明，葉酸缺乏可與多種腫瘤相關(guān)，例如食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌等。臨床流行病學(xué)研

3、究資料表明，體內(nèi)葉酸水平降低與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但缺少后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持且作用機(jī)制不清。因此進(jìn)一步探討補(bǔ)充葉酸對(duì)肝癌發(fā)生是否有防護(hù)作用及其作用的分子機(jī)制，可將其作為一種重要的肝癌化學(xué)預(yù)防的候選分子，為肝癌的早期預(yù)防提供扎實(shí)的理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 為了探討補(bǔ)充葉酸對(duì)肝癌發(fā)生是否有防護(hù)作用及其作用的分子機(jī)制，我們構(gòu)建了DEN誘發(fā)肝癌小鼠模型，從其斷奶后即給予不同葉酸濃度的飼料喂養(yǎng)，并于不同時(shí)期觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充葉酸可減輕DE

4、N誘發(fā)的肝損傷，并減少肝癌的發(fā)生。而近年來有眾多研究報(bào)道稱，EMT和肝損傷、肝硬化及肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此我們擬研究葉酸是否通過調(diào)控EMT進(jìn)而調(diào)控了肝損傷、肝硬化及肝癌的發(fā)生。我們通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，探討葉酸對(duì)EMT是否有調(diào)控作用。我們首先檢測(cè)了DEN模型小鼠肝組織EMT相關(guān)標(biāo)志分子的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉酸可以抑制小鼠肝臟EMT。隨后我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中，用不同葉酸濃度的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)人肝細(xì)胞12個(gè)月，結(jié)果證實(shí)葉酸可以抑制人肝細(xì)胞E

5、MT發(fā)生，提示葉酸可通過抑制EMT抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。與此同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，在肝癌的發(fā)生發(fā)展及EMT進(jìn)程中有染色質(zhì)修飾的改變。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(LSD1)在染色質(zhì)修飾改變過程中起著重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道稱， LSD1是葉酸的結(jié)合蛋白。因此，為研究葉酸是否通過調(diào)控LSD1進(jìn)而調(diào)控EMT，我們開展了一系列實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，葉酸確實(shí)可下調(diào)LSD1。之后，我們利用LSD1特異性抗體，組蛋白H3K4Me2特異性抗體，進(jìn)行染色質(zhì)免疫共

6、沉淀實(shí)驗(yàn)，證實(shí)葉酸通過下調(diào)LSD1，降低LSD1在EMT關(guān)鍵上皮鈣粘著蛋白基因（E-cadherin，CDH1）啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合水平，上調(diào)該基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3K4Me2水平，進(jìn)而上調(diào)其表達(dá)。最后，我們通過干擾和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了葉酸對(duì)上皮基因的調(diào)控作用依賴于LSD1。綜上所述，本研究證實(shí)了葉酸可下調(diào)LSD1，減少LSD1于CDH1啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，增加CDH1啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3K4Me2水平，從而上調(diào)了CDH1的表達(dá)，抑制EMT